基本信息
- 项目名称：
- 蜂胶总黄酮HPLC指纹图谱与抗氧化活性的相关性研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 为探讨蜂胶总黄酮指纹图谱与其抗氧化活性的关系，采用HPLC法制备不同产地的蜂胶总黄酮指纹图谱，依中国药典法进行抗氧化作用强度研究。应用多元回归法与广义回归神将网络（GRNN）建立蜂胶谱效预测模型，筛选得出对氧化时间有统计学意义的12个色谱峰（组）。通过谱效结合的研究方法，阐明蜂胶总黄酮指纹图谱与其抗氧化作用的关系，达到仅通过指纹图谱即可判定蜂胶的抗氧化活性，从而避免了人为因素对实验结果产生的误差。
- 详细介绍：
- 1 指纹图谱的制备 制备浓度分别为0.268mg/mL与0.1096mg/mL芦丁、槲皮素的对照品溶液。照王小平方法[14] 制备蜂胶指纹图谱，以芦丁和槲皮素保留时间为标准进行方法学考察，该指纹图谱稳定性（12小时内RSD<1%）、重复性（RSD<2%）良好，精密度符合要求（RSD<1% ）。 2抗氧化活性测定及相似度评价及分类 依中国药典法进行抗氧化活性测定（药典规定褪色时间不得超过22s），采用MATLAB加载的相似度评价软件，进行相似度评价。通过此软件分析得到18批蜂胶指纹图谱的共有模式以及每个图谱与其共有模式的相似度。结合相似度与抗氧化时间测定结果将18批蜂胶进行分类，并计算每一类中的组内相似度。 3 谱效数学方程的建立及验证 根据分类结果对于样品量在5个以上的类别抽取一个样品预留为验证实验样本，并舍去不合格样品，其他样品以共有峰（除去溶剂峰）峰面积为自变量，以高锰酸钾褪色速率为因变量，使用SPSS 13.0 进行逐步多元回归，建立谱效数学方程，用P<0.05为显著性鉴别依据判断该峰是否具抗氧化活性。并在第一类、第二类、第三类中随机抽选三个样品（因第四类样品只有两个样本不具有代表性不再抽取）保留进行验证试验。10号样品因为没有使高锰酸钾褪色，故不保留在回归分析范围之内，得回归方程如下： Y=-3425838.973-0.1572X1+0.14714X2+2.177X4-0.5882X5+3.858X6-1.479X7+0.02929X9+0.4403X10-0.3190X11+1.7043X13+0.3541X15+1.383X16 R=0.9999 X值为共有峰的峰面积，Y值为高锰酸钾氧化速率即共有峰峰面积之和与高锰酸钾褪色时间的商。 依法判断图中3、8、12、14、17号峰为无活性成分峰，1、2、4、5、6、7*、9、10*、11、13、15*、16*为活性成分峰或组峰（*为活性组分峰，依次在42-65min、71-74min、95-98min、103-108min）。 4 广义回归人工神经网络（GRNN）建立谱效模型 分别以多元回归前后的色谱峰面积作为网络输入，以高锰酸钾褪色时间（实际时间与3中预测时间）作为网络输出，采用MATLAB 2009构建GRNN模型。由于训练数据较少，采取交叉验证的方法训练GRNN神经网络，并用循环找出最佳的SPREAD，训练样本与预测样本同3.3，所选最佳SPREAD均为0.1。 4号与8号3.3验证实验中验证结果良好，GRNN神经网络筛选后的误差较筛选前下降。14号样品采用实验所得实际时间建立GRNN模型所得预测误差显著小于采用3.3中预测所得时间模型的误差，体现了人工神经网络良好的复杂性数据的学习能力。10样本因未能使高锰酸钾褪色，故采用0S为实际褪色时间，进行模型验证。
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撰写目的和基本思路
- 目的：为避免人为因素对实验结果造成影响，并科学的建立蜂胶药效控制平台。 基本思路：通过研究蜂胶HPLC指纹图谱与其抗氧化活性的相关性，应用多元回归与广义回归人工神经网络模型。达到仅通过HPLC指纹图谱即可判别蜂胶抗氧化活性的强度。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：指纹图谱为2010版药典所收录的技术，多元回归及广义回归神经网络模型均为成熟的数学方法，重复性强，客观性高。 先进性：通过药效对蜂胶进行质量评价，从而打破了真伪鉴别和忽略优劣鉴别的局限。 独特之处：人工神经网络模型目前无文献报道应用于中药指纹图谱谱效方面的研究，且GRNN人工神经网络无报道应用于中医药领域。
应用价值和现实意义
- 本论文已得到国内最大蜂胶企业—江苏江大源生态生物科技有限公司相关人员的认可，并表示有合作开发意向。本研究将直接对蜂胶药效进行评价，不仅解决了蜂胶掺假这一社会问题，并重视对于优品的保护，对于蜂胶有着深刻的应用价值。同时，本研究思路，可借鉴应用于其他药材的研究。
学术论文摘要
- 为探讨蜂胶总黄酮指纹图谱与其抗氧化活性的关系，本文采用HPLC法制备不同产地的蜂胶总黄酮指纹图谱，依中国药典法进行抗氧化作用强度的比较研究。并应用多元回归法与广义回归神将网络（GRNN）建立蜂胶谱效预测模型，筛选得出对氧化时间有统计学意义（P<0.05）的12个色谱峰（组）。通过谱效结合的研究方法，可逐步阐明蜂胶总黄酮HPLC指纹图谱与其抗氧化作用的关系，达到仅通过指纹图谱即可判定蜂胶的抗氧化活性，从而避免了人为因素对实验结果产生的误差。 关键词：蜂胶 HPLC指纹图谱 氧化时间 谱效关系 人工神经网络
获奖情况
- 2010年4月通过校级创新课题评审，优秀。（总排名第三，中药类第一） 并于2010年10月14日参加优秀课题报告会 2010年6月 课题得到广东省大学生创新课题资助，进行深入研究。 2011年3月12日 论文《Research on Correlativity between HPLC Fingerprint of Total Flavonoids of Propolis and its Antioxidant Activity》于深圳国际会展中心作报告，得到的中国养蜂学会秘书长陈黎及江大原生态总经理邵兴军、会务负责人丁德华先生的好评。
鉴定结果
- 2010年4月通过校级创新课题评审，优秀。（总排名第三，中药类第一） 2011年1月25日 论文通过2011国际蜂胶科学峰会，论文评审。 2011年3月通过学校挑战杯参赛资格评审。
参考文献
- [1]王宗伟，黄兆胜.蜂胶的药理作用[J]. 国外医药•植物药分册， 997，12：151—153. [2] 祁学，李震．蜂胶的化学成分及药理作用研究[J]. 长春中医学院学报2001，17(14) [3] 胡福良，玄红专，李英华．蜂胶的化学成分和植物来源的研究进展[J]. 中国现代应用药学杂志2002，19(16) [4] 李勇，杨晶凡．蜂胶的化学成分及药理作用研究进展[J]. 黑龙江医药，2005，18（8） [5]周萍，章征天，胡福良等. 蜂胶HPLC指纹图谱真伪鉴别初探[J].蜜蜂杂志,2005(10):5-6. [6]潘建国，王开发，段怡 等.蜂胶中10-羟基-癸烯酸的含量测定[J].中国养蜂,2005,56(10):4-5. [7] 李戎,闫志勇,李文军 等. 创建中药谱效关系学[J],中医教育,2002,2(3):62. [8] 王小平，林励，潘建国等. 蜂胶HPLC指纹图谱的研究[J]. 中草药，2008,10（10）：1499-1501
同类课题研究水平概述
- 蜂胶是采集工蜂从树木等植物新生枝芽或树枝上采集的树脂，并混入蜜蜂上颚腺分泌物和蜂蜡等加工而成的具有芳香粘性的固体胶状物。蜂胶内含黄酮类、萜烯类、酚类及酯类等生物活性物质，具有抗过敏、抗炎症、抗氧化、强化血管、抑制病毒、抗肿瘤、增强机体免疫力等药理功能。蜂胶含有众多的成分，目前已从蜂胶中分离得到的物质有300多钟，其中黄酮类化合物70多种，芳香族酸及酯类60多种，酚、醛、醇类40多种，萜烯类30多种，脂肪酸、氨基酸及其脂类近80种，烃类30多种等。蜂胶的化学成分可能由于蜜蜂采集地区的植物分泌物的不同，导致蜂胶成分相差很大，甚至可能完全不同。由于蜂胶的化学成分多样性，所以到目前还没有统一的蜂胶化学成分标准。研究结果表明，不同地区蜂胶的抗氧化活性不同，总酚类和总黄酮含量也不同，蜂胶的抗氧化活性与总酚类之间存在一定的相关性。不同地区蜂胶抗氧化活性的不同是多种成分相互协同作用的结果。 关于蜂胶成分的分析方法，国内外曾有高效液相色谱法、分光光度法、薄层色谱法、毛细管气相色谱法、电化学发光猝灭法。由于指纹图谱给出的有关质量的信息量远比任何单一成分测定所得的信息量要多，所以它能够有效的鉴别蜂产品的真伪和质量的优劣，反映蜂产品研制所用的原料、工艺贮存过程中化学成分的变化情况，更有效地进行蜂产品研究的全程跟踪，使研制的蜂产品质量更趋稳定和一致。现在已经建立分离度符合药典要求的10种不同产地蜂胶的HPLC指纹图谱。（分离度大于1.5）并且指纹图谱表明，不同产地蜂胶药材中化学成分的种类和量差异较大，说明产地对蜂胶的内在质量有较大影响。[并可以清晰地将蜂胶指纹图谱分成六个区，根据六个区的特征峰分布进行蜂胶与杨树树胶的鉴别。而对于蜂胶的体外抗氧化能力的测定方法到目前为止已经有十余种之多。
