基本信息
- 项目名称：
- 拟南芥中百合花药小热激蛋白LimHSP16.45同源基因的克隆及其耐热性和抗冷性研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 通过提取拟南芥中百合花药小热激蛋白LimHSP16.45同源基因AT-HSP17.6。将其导入大肠杆菌中，使其异源表达。之后在45℃高温和4℃低温胁迫下，分别于一定的时间内，测定这两种温度培养下菌液的OD值。结果表明该基因可在大肠杆菌中异源表达，而且导入该基因的大肠杆菌耐热性及抗冷性明显增强。蛋白体外活性检测，结果表明At-HSP17.6做为分子伴侣，能够保护荧光素酶的结构保持稳定的结构而不变性。
- 详细介绍：
- 详见附件论文
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 立项目的：1、克隆拟南芥AT-HSP17.6基因，分析保守区域，构建分子进化树探讨基因家族起源关系。2、构建原核表达体系，研究基因的功能。 基本思路：1、基因的鉴定与进化树构建:基因序列翻译成氨基酸序列，进行同源性检索，分析保守区域，构建进化树。2、大肠杆菌中表达：构建重组质粒，转化大肠杆菌。诱导蛋白质表达，做SDS-PAGE。在4℃和45℃下进行培养，测定菌液OD值并作图，探讨基因的功能。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：1、本实验以拟南芥、大肠杆菌为材料，培养周期短，易于对实验重复验证。2、实验涉及到PCR扩增、质粒提取、载体的构建及转化。实验方法适于本科生操作。 先进性：1、热激蛋白是当今分子生物学、蛋白质生物化学和植物抗逆生理学的研究热点。2、利用热激蛋白改良植物品种，利于环境的良性循环。 独特之处：小热激蛋白基因易于通过基因工程来改良作物品种，同时在不利环境下它能迅速产生相应的热激蛋白。
应用价值和现实意义
- 1、植物热激反应是植物抵抗不良环境的一种防御机制，如果能用基因工程方法提高热激蛋白基因的表达量，增强植物耐热和耐冷性，并研究其对后环境的影响，这无疑会带来巨大的经济价值。 2、近年来，生态环境的平衡日益遭到破坏，干旱、冻雨等不正常气候的挑战也愈加严峻，温室效应的加剧直接威胁着21世纪农业生产的发展，发展抗逆性农作物对全球粮食问题具有非凡的意义。
学术论文摘要
- 本实验通过提取拟南芥中百合花药小热激蛋白LimHSP16.45同源基因AT-HSP17.6。将其导入大肠杆菌中，使其异源表达。之后在45℃高温和4℃低温胁迫下，分别于2d，4d，6d，8d，10d时，测定这两种温度培养下菌液的OD值。结果表明：1、系统进化树分析结果表明AT-HSP17.6更接近于胞质Ⅱ型小热激蛋白基因，而且在进化上表现较近的遗传距离，说明植物小热激蛋白家族不同成员可能有不同的起源。2、该基因可在大肠杆菌中异源表达，而且导入该基因的大肠杆菌耐热性及耐冷性明显增强。 提纯异源表达蛋白，结果表明：At-HSP17.6做为分子伴侣，能够保护荧光素酶的结构保持稳定的结构而不变性。所以当加入不同浓度的At-HSP17.6后，关吸收值后适当降低。综上所述，本研究对小热激蛋白家族的功能研究和了解植物抗逆的分子机制具有一定的参考价值，在改善农作物抗逆研究中也具有一定的理论指导意义。
获奖情况
- 兰州大学第五届学术科技作品竞赛一等奖 兰州大学2010年"创新创业行动计划"一等奖
鉴定结果
- 本研究对小热激蛋白家族的功能研究和了解植物抗逆的分子机制具有一定的参考价值，在改善农作物抗逆研究中也具有一定的理论指导意义。
参考文献
- 1)Kelley PM and Schlesinger MJ. The effect of amino-acid analogues and heat shock on gene expression in chicken embryo fibroblasts. Cell, 1978,15(4):1277-1286. 2)Lee Y, Nagao RT, Lin CY, Key JL. Induction and Regulation of Heat-Shock Gene Expression by an Amino Acid Analog in Soybean Seedlings. Plant Physiol. 1996, 110(1):241-248 3)Nover L, Scharf KD, Neumann D. Formation of cytoplasmic heat shock granules in tomato cell cultures and leaves. Molecular and Cellular Biology, 1983, 3(9):1648-1655 4)Vierling E. The roles of heat shock proteins in plants. Plant Mol Biol, 1991, 42:579-620 5)郑国锠, 聂秀菀, 杨庆兰. 小孢子发生过程中花粉母细胞间染色质穿壁转移现象与机械损和固定液作用的关系.植物学报. 1964, 12:289-303 6)朱玉贤,李毅. 现代分子生物学(第二版) [M].北京,高等教育出版社, 2002,7:281-283 等16篇文献
同类课题研究水平概述
- 热激蛋白是生物体对逆境胁迫短期适应的必要组成成分，对减轻逆境胁迫引起的伤害有很大的作用，因此也被称为应激蛋白。它也成为当今分子生物学、蛋白质生物化学和植物抗逆生理学的一个重要研究内容。国内的研究方向主要是在它参与生物体内新生肽的运输、折叠、组装、定位以及变性蛋白的复性和降解。 植物的HSP研究始于20世纪80年代初。用较高但并非致死的温度进行处理，植物就会对通常是致死的温度产生耐热性(Yarwood，1961)，一些生长在温带的植物如大豆、玉米、甜椒和豌豆等，当组织温度超过32-33℃时就开始合成HSP，而且HSP的合成随温度的升高而增加(Lee等，1995；Nieto-Sotelo等，2002；Liu和Shono，1999；DeRocher和Vierling，1994)。然而，高温并不是唯一诱导HSP表达的刺激因子，乙醇、砷、重金属、氨基酸类似物，以及其它的一些理化因子会对不同生物体内HSP基因的表达产生部分或全部的影响(Key等，1981；Barnett等，1980；Cooper等，1983，1987)。 秦佳等(2007年)采用基因工程方法将CaMV35S启动子驱动的定位于番茄叶绿体基质中的hsp100/clpB 导入番茄, 使之组成型表达, 发现在4 ℃低温下处理21 d后, 转基因番茄比未转基因番茄表现出较轻的冷胁迫症状。Fv/Fm 能够反映PSII 的光能转化效率, 而低温胁迫会损伤PSII 从而导致Fv/Fm的下降。在4 ℃低温胁迫下, 非转基因番茄植株的Fv/Fm 值下降21.2%, 而转基因番茄的Fv/Fm 值只下降9.1%; 胁迫解除后, 转基因番茄的Fv/Fm 值恢复缓慢, 而非转基因植株则迅速死亡。 王佳颖等研究番茄线粒体小分子热激蛋白LeHsp23.8发现LeHsp23.8不但可以热激诱导产生，而且也被低温诱导表达；在35sCaMV启动子的调控下将LeHsp23.8基因转入番茄组成型表达，Northem blotting和Westernblotting分析表明转基因植株呈现较高的耐低温性，说明组成型表达线粒体小分子热激蛋白基因能提高番茄的抗冷性(王佳颖等，2008)。
