基本信息
- 项目名称：
- 同时检测CSFV和PRRSV一步法RT-PCR方法的建立及在云南部分地区的应用
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 猪瘟（CSF）和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害云南养猪业的疾病，二者同时感染猪群的比例很大，且在临床症状和病理变化上不易区分。为了建立一种能快速诊断CSF和PRRS混合感染的方法，根据NCBI上已发表的CSFV保守基因Erns和PRRSV保守基因M基因的核苷酸序列，设计了2对特异性引物，经优化PCR反应条件后，建立了CSFV和PRRSV一步法RT-PCR的检测方法。
- 详细介绍：
- 近几年，在云南省部分地区中经常发生猪高热病大部分诊断为蓝耳病病毒与猪瘟病毒混合性感染所致。猪瘟是一种烈性传染病，给世界养猪业造成了重大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征是20世纪80年代后期出现的，以母猪繁殖障碍和各日龄猪呼吸道疾病为特征的传染病。这两种病在临床症状和病理变化上不易区分，而且二者在云南地区同时感染猪群的比例很大。目前，常规方法大都无法同时检测这2种病毒，所以建立一种同时检测和区分这2种病毒的方法十分必要。针对云南省猪病发生情况，以及猪瘟病毒及蓝耳病病毒均属于RNA病毒这一特点，本研究设计了一步法RT-PCR方法同时检测这两种病毒核酸的方法，大大节约时间和试剂，也避免了实验过程中反转录和PCR多个环节造成污染的机会。用本研究建立的一步法RT-PCR方法对云南地区部分猪场送检的“高热病”发病猪的样品进行了检测，检测结果与猪瘟病毒和蓝耳病病毒商品化试剂盒检测结果进行比较，证实本研究设计的引物的敏感性完全满足一般实验室检测需要。本研究为云南猪瘟和蓝耳病混合感染的快速检测提供了重要的技术支持。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 猪高热病近几年在云南省部分地区中经常发生。其中大部分诊断为蓝耳病毒与猪瘟病毒混合性感染所致。为了建立一种能快速诊断这两种病混合感染的方法，利用复合一步法PCR技术原理，根据猪瘟病毒保守基因Erns和蓝耳病病毒保守基因M基因的核苷酸序列，设计2对特异性引物。修改引物位置、优化引物参数，同时对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行优化及测定，建立猪瘟病毒和蓝耳病病毒一步法RT-PCR的检测方法。
科学性、先进性及独特之处
- 动物传染病的确诊通常需要病原学检测，目前常用的检测方法中，RT-PCR的特异性和敏感性较高。复合一步法PCR方法不但可以同时扩增两条目的基因，而且也节省了试剂，减少了污染的机会。本研究建立的一步法RT-PCR方法能在一次反应中对所怀疑的由CSFV和PRRSV 2种病原体引起的传染病进行病原诊断，且特异、敏感、快速、简便，具有广阔的应用前景。
应用价值和现实意义
- 蓝耳病与猪瘟这两种病在临床症状和病理变化上不易区分，而且二者在云南地区同时感染猪群的比例很大。目前，常规方法大都无法同时检测这2种病毒，所以建立一种同时检测和区分这猪繁殖与蓝耳病病毒的方法十分必要。本研究设计了一步法RT-PCR方法同时检测这两种病毒核酸的方法，设计的引物的敏感性完全满足一般实验室检测需要。本研究为云南猪瘟和蓝耳病混合感染的快速检测提供了重要的技术支持。
学术论文摘要
- 猪瘟和蓝耳病是严重危害云南养猪业的疾病,为了建立一种能快速诊断猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征混合感染的方法，根据NCBI上已发表的猪瘟病毒保守基因Erns和蓝耳病病毒保守基因M基因的核苷酸序列，利用Oligo 6.0设计了2对特异性引物，经过PCR反应条件优化后，建立了猪瘟病毒和蓝耳病病毒一步法RT-PCR的检测方法。在云南部分地区中猪高热病病料检测的结果表明，本方法具有良好的特异性、重复性和稳定性，本研究为云南猪瘟和蓝耳病混合感染的快速检测提供了重要的技术支持。
获奖情况
- 2011年5月获云南农业大学第九届“挑战杯”学生课外学术科技作品竞赛一等奖； 2011年6月获云南省第六届高校青年学术科技作品竞赛三等奖； 2011年6月文章发表于核心期刊《动物医学进展》；
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] 冷和平, 温育铭, 曾俊霞, 等.猪瘟对我国当前养猪业危害的客观评价及其有效防治措施[J].猪业科学，2009，26(6)：74-77. [2]李让云. 猪蓝耳病与猪瘟混合感染的防控[J]．畜牧与饲料科学，2010，(2)：182-183. [3] Cheon D，Chae C. Comparison of virus isolation，reverse transcription polymerase chain reaction，immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus from naturally aborted fetuses and stillborn piglets[J]. J Vet Diagn Invest, 2000, 12: 582-587. [4] Soares R M, Durigon E L, Bersano J G, et a1．Detection of porcine parvovirus DNA by the polymerase chain reaction assay using primers to the highly conserved．Non-structural protein gene NS-l [J]. J Virol Methods, 1999, 78: 191-198. [5] Van Woensel P, Vander W J, Visser N. Detection of porcine reproductive respiratory syndrome virus by the polymerase chain reaction [J]. J Virol Methods, 1994, 47: 273-278. [6]覃芳芸, 黄夏, 陈义祥, 等.CSFV的RT-PCR检测在控制与净化猪瘟中的应用[J]．动物医学进展，2007，28(6)：17-18.
同类课题研究水平概述
- 猪瘟是一种烈性传染病，给世界养猪业造成了重大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征是20世纪80年代后期出现的，以母猪繁殖障碍和各日龄猪呼吸道疾病为特征的传染病。这两种病在临床症状和病理变化上不易区分，而且二者在云南地区同时感染猪群的比例很大。目前用于动物传染病的方法有很多种，如分离鉴定、抗体检测的免疫过氧化物单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、血清中和试验(SVN)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。病原的分离鉴定耗时耗力，且有许多干扰因素，这些方法一般都比较繁琐，而且准确度不高，不利于疾病的快速诊断。而RT-PCR具有高敏感度、高特异性、快速简便等优点，已广泛应用于RNA病毒病的诊断，在CSF和PRRS的诊断上也取得了很大进展。 聚合酶链式反应(PCR)技术已渗透到生命科学的各个领域，多重PCR技术是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术，在临床诊断上潜力十分巨大。近年来多重PCR技术有关文献已有几百篇，多重PCR方法已被成功地应用到了生物学的多个方面，如各类病原的检测与鉴别、遗传疾病诊断、以及基因缺失、突变和多态性分析等。该技术已经比较成熟，但应用多重一步法RT-PCR技术对动物疾病病原进行鉴别诊断的报道却不多，且任然存在一定的技术问题，如在双重PCR反应体系中，同时扩增两个基因，设计引物时如何避开发夹结构；退火温度不能过高或过低，且要使两对引物退火温度相等或接近；保证GC含量相等或接近，以避免引物与引物之间的杂交等。目前该技术仅处于实验室的试验研究阶段，尚未进入临床应用。
