基本信息
- 项目名称：
- 单增李斯特菌LAMP检测试剂盒
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 本作品已经建立了一种适合于快速检测单增李斯特菌的环介导等温扩增（LAMP）方法。以单增李斯特菌LM-CMC54002的iap基因为目标序列，设计内外引物用于LAMP扩增，结果肉眼可见。灵敏度分析显示LAMP检测的灵敏度高出荧光定量PCR10倍。且检测结果可通过肉眼直接观察。这一方法的建立能很好地克服其他检测手段耗时长，操作繁琐以及对仪器的依赖等弊端，尤其适用于在基层单位推广，实现现场快速检测。
- 详细介绍：
- 单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称“单增李斯特菌”）属于李斯特菌属,其在自然界分布广泛,是危害公共卫生和食品行业的一种重要人畜共患致病菌，其致病性与多个毒力因子密切相关。动物性食品是其主要传播源，可使人畜患脑膜炎、心肌炎、败血症、死婴、早产等疾病，危害较大，死亡率达到20%~30%，在我国香港、福建、辽宁和云南等地有过因该菌引发疾病而住院或死亡的报道。该菌可在4℃仍可生长，对冷冻产品和速食食品构成威胁，包括我国在内的很多国家都规定食物中不得检出单增李斯特菌，因此建立一种快速、准确有效的检测单增李斯特菌的检测方法，是食品安全重要课题之一，有着十分重要的意义。 本作品已经建立了一种适合于快速检测单增李斯特菌的环介导等温扩增（LAMP）方法。以单增李斯特菌LM-CMC54002的iap基因为目标序列，设计内外引物用于LAMP扩增，通过肉眼观察白色沉淀来判断检测结果。灵敏度分析显示LAMP检测单增李斯特菌基因组的灵敏度达到9.6fg/μL，高出荧光定量PCR的检测限10倍。且检测结果可通过肉眼直接观察。这一方法的建立能很好地克服其他检测手段耗时长，操作繁琐以及对仪器的依赖等弊端，尤其适用于在基层单位推广，实现现场快速检测。
作品图片
作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 创新点 本项目拟根据GenBank中已报道的单增李斯特菌的多个毒力因子序列，设计一套针对LAMP方法所需要的引物，建立单增李斯特菌LAMP快速检测方法，开发一种适合于基层单位推广应用的单增李斯特菌核酸等温快速扩增的检测试剂盒。这一方法的建立能很好地克服其他检测手段耗时长，操作繁琐以及对仪器的依赖等弊端，尤其适用于在基层单位推广。 关键技术 1、单增李斯特菌毒力因子基因片段LAMP扩增引物序列的设计；2、LAMP扩增条件的优化（包括反应液的组成、比例和浓度等）； 主要技术指标 （1）特异性大于98%，假阳性率低于5%；（2）检测时间在1.5个小时内完成；（3）灵敏性：菌落最低检测限达到10CFU/mL；标本的检出率达到95%以上；（4）鉴定方法：通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤；
科学性、先进性
- LAMP技术的特点： 1、操作简便、不需要PCR仪器；2、特异性强、检测限更小；3、等温、耗时短；4、高效；5、产物易检测。 利用这些特点，建立病原微生物的鉴定检察方法具有高效率、高特异性、高敏感性等特点，克服了传统PCR固有的检测时间长、检测成本高等缺点。 此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的仪器设备。LAMP方法在流行性病毒检测、临床诊断等领域的应用及研究已有文献报道，但在水产品中致病微生物检测方面国内外罕见这方面的研究报道。
获奖情况及鉴定结果
- 1. 研究结果已撰写一篇研究论文（英文，拟投SCI）和专利，待投稿。 《Determination of Listeria monocytogenes in food by loop-mediated isothermal amplification》 2. 单增李斯特菌LAMP试剂盒产品经杭州迪恩科技有限公司试用良好。
作品所处阶段
- 中试阶段
技术转让方式
- 公司试用阶段，试用效果好，考虑深入合作。
作品可展示的形式
- 实物展示
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 项目的技术特点和优势 LAMP方法的优点是灵敏度高，反应时间短，临床使用不需要特殊的仪器，操作简单，肉眼观察结果。 作品的适用性范围及推广前景 通过网络和到公司与检测机构调研LAMP检测方法在食品安全快速检测中的应用前景，市场上常用检测方法的不足和本作品建立的LAMP检测方法的便捷、快速特性使得本方法具备良好的市场应用前景。 该检测方法及其试剂盒检测时间短、检测成本低、对检测人员的技术素质要求较低、实际操作极为简便和不需要特殊的仪器设备等优势将易于推广，尤其适用于在基层单位推广。同时目前市场上还未见有单增李斯特菌LAMP检测试剂盒产品。因此，本项目其应用前景十分广阔。 市场分析和经济效益预测 市场分析：本产品实验操作简便，特异性强，检测灵敏度高，耗时时间短，能很好的满足快速检测的要求。与市场上同类产品比较有很大的竞争优势。 成果的经济效益预测：生产成本控制在20元/次检测，销售价格控制在40元/次检测。本项目形成中试规模至大规模生产后，经济效益将十分显著。
同类课题研究水平概述
- 单增李斯特菌的传统检测方法包括选择性培养、生化鉴定等步骤，耗时长、灵敏性差，很难满足安全快速检测要求。随着分子生物学技术的发展，陆续开发出了以单增李斯特菌核酸特异性序列为检测对象的PCR方法、核酸探针方法等分子生物学方法，从基因水平更准确、灵敏的检测单增李斯特菌, PCR技术在检测食品性致病菌方面得到了广泛的应用。PCR技术结合其它技术又衍生出了许多PCR优良术。现在应用较多有荧光定量PCR技术、反转录PCR、多重PCR、巢氏PCR等。这些新的PCR技术在对单核细胞增生性李斯特菌的检测上也都得到了一定的应用。 LAMP快速检测方法作为一种新兴的核酸检测手段，具备了许多适合于快速检测的优点。操作简单，检测仪器要求低，只需一台能保持恒定温度的水浴锅即可，实验结果可直接肉眼观察进行判断，整个检测时间可以在1.5个小时内完成，可以建立起一种成本低廉的检测体系。在食品卫生质量检验、临床疾病诊断及基因芯片开发等领域具有广阔的应用前景。开发相应的诊断试剂盒,有望成为简易的常规检测手段。
