基本信息
- 项目名称：
- 中国蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库的构建
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 我们前期采用蛋白质组学技术，从中国蛇岛蝮蛇蛇毒中鉴定出20余种蛋白[5]，获得了检出蛋白的部分氨基酸序列，为目的蛋白基因克隆提供了信息。为探索和开发具有中国自主知识产权的蛇类药用基因，进一步对中国蛇岛蝮蛇蛋白活性组分表达和功能进行研究，加强对中国蛇岛蝮蛇的保护，我们构建了中国蛇岛蝮蛇毒腺的cDNA文库，并对文库进行了分析。
- 详细介绍：
- 为研究中国蛇岛蝮蛇(Gloydius shedaoensis shedaoensist)基因工程产品，采用SMART(switching mechanism at 5’ end of RNA transcript) 技术构建其毒腺的cDNA表达文库。采用RNAiso 试剂提取毒腺总RNA，再采用Poly (A) PuristTM 试剂盒分离纯化mRNA，第一链cDNA经反转录合成，双链cDNA经LD-PCR合成并扩增；分级分离去除小片段，收集大于400 bp的cDNA片段，与质粒栽体pDNR-LIB连接，采用电转化法将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞DH10B。构建的蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库库容量为8×107 cfu/ml，大多数插入片段大于1 000 bp，重组质粒表达率高(100%)。本研究成功构建了高质量的蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库，表达文库质量高，可用于进一步克隆和表达GSS蛋白活性组分基因，并对其功能进行研究。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：构建完整的cDNA文库，为基因工程制取中国蛇岛蝮蛇蛇毒奠定基础 基本思路：提取毒腺总RNA，并分离纯化mRNA，第一链cDNA经反转录合成，双链cDNA经LD-PCR合成并扩增；分级分离去除小片段，收集大于400 bp的cDNA片段，与质粒栽体pDNR-LIB连接，采用电转化法将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞DH10B。
科学性、先进性及独特之处
- 传统cDNA文库构建方法难以获得低丰度表达基因，需消耗大量mRNA、难合成完整、文库构建繁琐耗时。中国蛇岛蝮蛇为国家级保护特有蛇种，通过增加毒腺数量获得大量mRNA是行不通的。本研究采用SMART方法，解决了以上问题，一条中国蛇岛蝮蛇的毒腺就可满足cDNA文库的构建。且SMART方法能保证cDNA序列信息完整性，获得全长基因机率高所构建质粒文库不需体外包装，易扩增保存、筛选和利于目的基因表达。
应用价值和现实意义
- 我们前期采用蛋白质组学技术，从中国蛇岛蝮蛇蛇毒中鉴定出20余种蛋白[5]，获得了检出蛋白的部分氨基酸序列，为目的蛋白基因克隆提供了信息。为探索和开发具有中国自主知识产权的蛇类药用基因，进一步对中国蛇岛蝮蛇蛋白活性组分表达和功能进行研究，加强对中国蛇岛蝮蛇的保护，我们构建了中国蛇岛蝮蛇毒腺的cDNA文库，并对文库进行了分析。
学术论文摘要
- 为研究中国蛇岛蝮蛇(Gloydius shedaoensis shedaoensist)基因工程产品，采用SMART(switching mechanism at 5’ end of RNA transcript) 技术构建其毒腺的cDNA表达文库。采用RNAiso 试剂提取毒腺总RNA，再采用Poly (A) PuristTM 试剂盒分离纯化mRNA，第一链cDNA经反转录合成，双链cDNA经LD-PCR合成并扩增；分级分离去除小片段，收集大于400 bp的cDNA片段，与质粒栽体pDNR-LIB连接，采用电转化法将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞DH10B。构建的蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库库容量为8×107 cfu/ml，大多数插入片段大于1 000 bp，重组质粒表达率高(100%)。本研究成功构建了高质量的蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库，表达文库质量高，可用于进一步克隆和表达GSS蛋白活性组分基因，并对其功能进行研究。
获奖情况
- 获2011年大连医科大学科技创新一等奖
鉴定结果
- 构建的文库库容量为8×107，完全满足使用要求，l6个随机挑选单菌落的PCR结果均显示含有重组质粒。提取扩增后文库质粒，经琼脂糖凝胶电泳检测弥散条带明显片段分子量大于一千bp，表明构建文库完整。
参考文献
- [1] Liu S, Sun M, Sun C, et al. A novel serine protease from the snake venom of Agkistrodon blomhoffii ussurensis. Toxicon, 2008, 52(7): 760–768. [2] Liu S, Sun M, Greenaway F T. A novel plasminogen activator from Agkistrodon blomhoffii Ussurensis venom (ABUSV-PA): Purification and characterization. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 348(4): 1279–1287. [3] 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔D W: 黄培堂等译. 分子克隆实验指南 ( 3版). 北京: 科学出版社，2002, 857–916． [4] 钟肖芬，卫剑文，赵贵军，等. 平颏海蛇毒腺cDNA表达文库的构建. 中山大学学报(自然科学版)，2001，40(3): 66–69
同类课题研究水平概述
- cDNA文库的建立为深入研究中国蛇岛蝮蛇蛇毒有效成分提供了重要的基因资源，在基因序列与蛋白之间架起一座桥梁。不仅可以用于检测许多已知基因，同时也可获得新基因，并且使进一步采用基因工程技术生产蛇毒制剂成为可能。 传统cDNA文库构建方法难以获得低丰度表达基因，需消耗较大量mRNA、难合成完整的cDNA、文库构建步骤繁琐耗时。中国蛇岛蝮蛇为国家级保护特有蛇种，通过增加毒腺数量获得大量mRNA是行不通的。 近年来 ，D NA文库构建的新方法 、新技术虽多种多样、层出不穷但其共同目的是使得D NA文库构建更加迅速、简便 、高效、高质量、满足研究的需要。 其中包括以下几种重要方法： 一、固相 c DNA文库构建 二．Ol i g o—c a p p i n g方 法构 建 c DNA文库 三、录病毒c DN A表达系统构建
