基本信息
- 项目名称：
- 人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor的基因克隆与序列分析
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- Hespintor是应用抑制性差减扣除杂交技术从肝母细胞瘤细胞系HepG2中筛选得到一未知功能新基因，经RT-PCR验证后，结合生物信息学确定该基因属于一种新的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子。同源分析表明，Hespintor具有与食管癌相关基因2（ECRG2）高度同源的serpin基本结构。由于ECRG2具有抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移等作用，因此提示Hespintor可能具有同样的能力。
- 详细介绍：
- 丝氨酸蛋白酶抑制因子是一类丝氨酸蛋白酶活性调节因子，参与血凝、纤维蛋白溶解、炎症和免疫反应、胚胎发生及个体发育过程。根据它们的序列、二硫键数目和三维结构，至少可以归类为18个非同源蛋白质家族。其中，Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子是较为保守的家族之一，最近越来越多的研究显示该家族的某些成员参与调节肿瘤细胞的侵袭与转移。 Hespintor是应用抑制性差减扣除杂交技术研究了乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节靶基因，从肝母细胞瘤细胞系HepG2中筛选得到一未知功能新基因，经RT-PCR验证后，结合生物信息学确定该基因属于一种新的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子（GenBank Accession：DQ438947）。同源分析表明，Hespintor具有与食管癌相关基因2（esophageal cancer related gene 2，ECRG2）高度同源的serpin基本结构。由于ECRG2具有抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移等作用，因此提示Hespintor可能也具有抑制肿瘤的侵袭与转移的能力。Hespintor与包括ECRG2在内的其它Kazal家族成员在基本结构上既有相似性又有独特性，它在细胞中的生物学功能以及抗肿瘤作用有待于深入研究。 UniGene数据库从属于GeneBank数据库，专门收集非冗余性的基因来源的clusters数据。每一个UniGene Cluster代表单一基因的序列和相关的信息，例如基因表达的组织类型和染色体图谱定位信息。除了这些具有特征的序列以外，成千上万的EST也被收录在内。因此，这些相应收集的资源可以作为基因发现的来源。当前，Unigene已收录了多个物种的序列，选择这些物种是因为它们有大量的EST可用数据，即Unigene数据库完全是以实验体系为基础建立起来的。分析发现，Hespintor基因在正常组织中有表达，但在肿瘤细胞（除生殖细胞瘤外）中不表达，强烈提示Hespintor的表达缺失可能与肿瘤的侵袭转移相关。 生物信息学是以生物大分子为研究对象，以计算机为工具，运用数学和信息科学的观点理论和方法，去研究生命现象、组织和分析呈指数级增长的生物信息数据的一门科学。伴随计算机网络的发展而产生，其强大的功能使其已经成为生命科学研究的重要手段。目前，基因和蛋白质序列数据库呈现几何级数增长，需要生物与计算机技术紧密结合的生物信息学对其进行分析，以阐明生物的本质，因此生物信息学研究重点体现在基因组学和蛋白质两个方面。该系统由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成，其关注的研究热点包括：序列对比、基因识别、DNA序列分析、蛋白质结构预测和分子进化研究。 利用ExPASy系统预测Hespintor，蛋白二级结构预测表明，该蛋白仅由螺旋和折叠组成，不涉及转角和无规则卷曲。继续的预测表明，Hespintor具有信号肽，属于分泌蛋白，与其亚细胞定位于细胞外的预测结果相符。当然，在对目的基因及其编码蛋白信息一无所知的情况下，包括结构与功能、表达与调控、生物学功能与医学意义，应用生物信息学技术对目的基因进行分析具有重要的指导意义，为进一步的实验研究奠定了坚实的基础。尽管如此，所有预测结果仍然需要实验来最终验证。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 肿瘤细胞侵袭转移能力的强弱与其诱导产生的蛋白酶降解ECM及基膜的能力密切相关，抑制这些蛋白酶活性，就有可能影响肿瘤的进程，成为治疗肿瘤的有效方法。Hespintor是一种新发现的Kazal型人类丝氨酸蛋白酶抑制因子，可能具有抑制肿瘤的侵袭与转移的能力。为此我们克隆了Hespintor基因，并进行生物信息学分析，为进一步探究其生物学功能及其在抑制肿瘤转移机制中的可能作用提供实验依据。
科学性、先进性及独特之处
- Hespintor具有与食管癌相关基因2（ECRG2）高度同源的serpin基本结构。由于ECRG2具有抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移等作用，因此提示Hespintor可能也具有抑制肿瘤的侵袭与转移的能力。Hespintor与包括ECRG2在内的其它Kazal家族成员在基本结构上既有相似性又有独特性，它在细胞中的生物学功能以及抗肿瘤作用有待于深入研究。
应用价值和现实意义
- 肿瘤细胞水解细胞外基质是肿瘤浸润和转移过程中的重要步骤，需要一系列的蛋白酶参与。肿瘤细胞分泌的尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA，一种丝氨酶蛋白酶）是肿瘤局部浸润和/或形成远处转移的限速步骤。因此，干预uPA水平或功能可以达到治疗肿瘤的目的，其中以Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子抑制uPA活性最为直接也最具有临床应用前景。
学术论文摘要
- 目的：克隆人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因，并应用生物信息学对其进行分析。方法：应用RT-PCR技术，扩增获得Hespintor基因片段，插入至TA克隆载体中，转化感受态细胞，蓝白斑法筛选阳性克隆菌落，进行菌落PCR及双酶切提取质粒，测序鉴定。然后登录ExPASy对其进行分析。结果：克隆得到Hespintor基因，其染色体定位于5q33.1，在正常组织中有表达，但在肿瘤细胞（除生殖细胞瘤外）中不表达；蛋白仅由螺旋和折叠组成，含有信号肽和一个糖基化部位，亚细胞定位于细胞外。结论：成功克隆了Hespintor基因，分析发现其属于Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子家族中的一个分泌型新成员。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] J Virol. 2010; 84(2):907-17. [2] Cancer. 2007 May 15;109(10):2142-53. [3] J Gastroenterol. 2006; 41(9):832-836. [4] Arch Biochem Biophys. 2008; 479(2):153-157. [5] Carcinogenesis. 2007; 28(11):2274-2281.
同类课题研究水平概述
- 1、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子的结构 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子一般是由一个或多个重复保守的Kazal结构域所组成。典型的Kazal结构域通常是由50～60个氨基酸残基组成，其中包括6个半胱氨酸残基和一个较为保守的序列模型。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子家族成员多为小分子多肽，其中某些成员能够抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，影响细胞因子和信号转导途径分子的表达，从而成为肿瘤治疗的新靶点。 2、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子家族的主要成员 2.1 胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂（PSTI） PSTI又称丝氨酸蛋白酶抑制因子KazalⅠ型，是最早分离鉴定的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子家族成员之一，能抑制胰蛋白酶和其它丝氨酸蛋白酶。PSTI的主要功能是保持消化道粘膜的完整性，避免粘膜被胰蛋白酶等过度消化。如果PSTI活性改变，容易形成溃疡等消化道疾病，成为进一步癌变的基础。因此，PSTI活性的保持对于预防消化道肿瘤具有重要影响。 2.2 肿瘤相关的胰酶抑制剂（TATI） TATI为己经应用于临床诊断的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子。多种癌症的患者血清及尿液中的TATI浓度明显升高，因此TATI作为分子标志物被用于临床诊断参考。TATI作为serpin通过与上述蛋白酶的作用可抑制ECM的降解，进而抑制肿瘤的增殖、侵润和转移，还能抑制可溶性Ⅰ型胶原的降解，并且直接抑制MMP前体的激活。由此推断，TATI通过参与胶原降解的级联酶解网络系统，抑制肿瘤细胞的侵润和转移。 2.3 反向诱导富含半胱氨酸带有Kazal模体的蛋白（RECK） RECK在多种人类组织和未转化的细胞系中表达，但在肿瘤细胞系及恶性转化的细胞系中不表达。它能够与MMP9结合并抑制其活性，提示RECK可通过MMP9参与肿瘤的侵润和转移。动物实验中，表达RECK的纤维母细胞瘤的血管生成启动被强烈抑制，提示其可抑制肿瘤的血管形成。以上研究表明RECK表达下降将导致肿瘤细胞的恶性演进，因而被认为是潜在的抑癌基因。 2.4 食管癌相关基因2多肽（ECRG2） ECRG2是近年来由我国学者发现的一种Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子，其mRNA在正常人的食管中表达而在食管癌细胞中表达下调。食管癌细胞系单独转染ECRG2基因能够抑制细胞的增殖，而阻断其表达则对细胞增殖的抑制作用消失
