基本信息
- 项目名称：
- SOE PCR重构SLA-I复合体的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 作品介绍了一种利用SOE PCR方法在体外重构SLA-I复合体的研究。猪SLA-I类分子在体内由重链和轻链以非共价键构成。本研究拟在体外将SLA-I重链基因SLA-2和轻链基因β2m重构，并在pMAL-p2X系统上表达。结果显示，利用SOE PCR技术成功构建了复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m，并在pMAL-p2X系统成功表达。本研究为今后在体外进行相关基因重组表达提供参考。
- 详细介绍：
- 猪的SLA-I类分子由重链由重链分子和轻链β2m构成。猪SLA-I重链有3个功能基因座，分别称为SLA-1 (PD1)，SLA-2 (PD14)和SLA-3 (PD7)。而轻链只有β2m基因编码，在体内与重链以非共价键结合，并起到支持和稳定重链结合抗原多肽表位的作用。如何在体外研究猪SLA-I重链，轻链和多肽表位的结合是一个值得探讨的问题。为此，需要在体外重构SLA-I类分子复合体。 剪接重叠延伸PCR(splicing overlap extension polymerase chain reaction, SOE PCR)技术由Horton于1989年首先发明，并且和之前Mullis发明的PCR技术相结合，旨在体外连接两个功能相关基因成一个复合体基因链的技术。 本研究拟利用SOE PCR技术，中间加一富含甘氨酸/丝氨酸的linker (G4S)3，将SLA-I重链基因SLA-2和轻链基因β2m连接，形成复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m，然后将复合体基因链克隆入p2X表达质粒，导入受体菌TB1并进行表达。结果显示，利用SOE PCR技术成功得到了复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m，并且克隆入p2X载体。SDS-PAGE检测表明，复合体基因导入宿主菌后获得了融合蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m，大小为84.1ku。本研究为今后在体外进行相关基因。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 作品目的：研究SOE PCR的条件；构建猪SLA-I复合体并进行表达 基本思路：利用SOE PCR技术，中间加一富含甘氨酸/丝氨酸的linker (G4S)3，将SLA-I重链基因SLA-2和轻链基因β2m连接，形成复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m，然后将复合体基因链克隆入p2X表达质粒，导入受体菌TB1并进行表达。
科学性、先进性及独特之处
- 本作品利用SOE PCR技术将SLA-2重链基因和β2m轻链基因中间通过柔性接头Linker在体外进行重组，并对其SOE PCR条件进行优化，最后成功在pMAL-p2X系统表达，实现了两个基因的重组和表达。该作品的研究方法具有明显的科学性，其研究技术手段目前对于两个相关功能基因相互作用规律的研究仍然具有重要的参考价值。
应用价值和现实意义
- 本研究一方面在体外通过SOE PCR技术构建了猪SLA-I类的复合体，为今后进行SLA-I体外多肽结合等功能研究奠定了基础，另一方面也对SOE PCR的扩增有关条件进行了优化，为今后进行其他相关基因的研究提供了新的数据。
学术论文摘要
- 利用SOE PCR技术，中间加一富含甘氨酸/丝氨酸的linker (G4S)3，将SLA-I重链基因SLA-2和轻链基因β2m连接，形成复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m，然后将复合体基因链克隆入p2X表达质粒，导入受体菌TB1并进行表达。结果显示，利用SOE PCR技术成功得到了复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m，并且克隆入p2X载体。SDS-PAGE检测表明，复合体基因导入宿主菌后获得了融合蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m，大小为84.1kDa。本研究为今后在体外进行相关基因重组表达提供参考。
获奖情况
- 作品：SOE PCR重构SLA-I复合体的研究.在2010年09月31日发表于全国中文核心期刊《动物医学进展》2010,31（9）:58-62
鉴定结果
- 经大连大学团委和素质教育基地等有关部门鉴定，论文发表情况属实。在2010年09月31日发表于全国中文核心期刊《动物医学进展》2010,31（9）:58-62
参考文献
- [1] Horton R, Hunt H, Ho SN, Pullen JK, Pease LR. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension[J]. Gene, 1989;77(1):61-8. [2] Mullis K, Faloona F, Scharf S, et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction[M]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1986;51 Pt 1:263-73. [3] Wiseman R, Karl J, Bimber B, et al. Major histocompatibility complex genotyping with massively parallel pyrosequencing[J]. Nat Med, 2009;15(11):1322-6. [4] Malkki M, Gooley T, Horowitz M, et al. MHC class I, II, and III microsatellite marker matching and survival in unrelated donor hematopoietic cell transplantation[J]. Tissue Antigens, 2007;69 Suppl 1:46-9. [5] Lunney J, Ho C, Wysocki M, et al. Molecular genetics of the swine major histocompatibility complex, the SLA complex[J]. Dev Comp Immunol, 2009;33(3):362-74. [6] 高凤山, 姜平, 方青美,等. 重构猪SLA-I单链复合体及其口蹄疫病毒VP1蛋白限制性表位的筛选[J]. 自然科学进展, 2007;17(6):724-30.
同类课题研究水平概述
- SOE PCR可以把两个相关的基因通过一个富含甘氨酸/丝氨酸的Linker (G4S)3连接在一起，从而可以非常方便的研究两个相关基因之间的作用和功能。该Linker中，甘氨酸是最简单的氨基酸，由于甘氨酸缺少侧链（只有一个H），因此β转角中能很好调整其它残基的空间，不易产生碰撞，可用于调节β片层的扭曲和曲度，基本上不影响β折叠片的结构；丝氨酸则常出现在转角或无序结构。二者组成的接头仅有3.5nm的跨度，不会在折叠过程中形成二级结构，从而不会影响表达蛋白的正确折叠及蛋白功能的发挥。Gao等最近报道了在体外通过SOE PCR技术构建SLA-I复合体，并通过表达及多肽结合研究证明构建的复合体可以用于体外结合多肽研究。Jeong等也报道了利用SOE PCR技术来构建乳酸菌带有绿色荧光蛋白的表达载体。本研究是参考以上研究，并细化SOE PCR的每一步骤，包括中间过程循环次数的优化等，得到循环次数为18的最佳条件，这个与报道的循环次数为16稍有差别，从而为今后进行其他相关基因的研究提供了参考依据。 原核表达系pMAL/p2X是一种可溶性表达系统，该系统含有Ptac强启动子，表达编码MBP的malE基因。外源基因插入到malE的下游，与MBP以融合蛋白的形式表达。在MBP前的信号肽介导融合蛋白到细胞周质中表达，这样便于形成二硫健和蛋白的正确的折叠，特别适用于分泌性蛋白如MHC的表达，有助于蛋白保持正确的构象。在malE和多克隆位点之间，有一个被蛋白酶Factor Xa因子识别的氨基酸序列，Ile-Glu-Gly-Arg，可以把MBP和目的蛋白切割分离。本试验通过诱导表达，成功获得了复合体基因的融合表达蛋白，从而丰富了体外构建SLA-I复合体的资料，为今后开展该复合体结构和功能的研究奠定了基础。
