基本信息
- 项目名称：
- 瑞士乳杆菌直投式发酵剂的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 本发明提供了一种常温下制备乳酸菌直投式发酵剂的方法，旨在提供一种制备过程简单，成本低廉，具有很高的生物量和活性，能够实现工业化的制备乳酸菌直投式发酵剂的方法。去皮的馒头块上添加乳糖和甘油作为保护剂后作为载体；将乳酸菌菌悬液在无菌条件下包被到馒头载体上，制得乳酸菌发酵剂；后室温无菌鼓风干燥，得到乳酸菌直投式发酵剂。该方法值得的发酵剂具有很高的菌存活率、活性和生物量。而且，简单易行，成本低廉。
- 详细介绍：
- 一种常温下制备乳酸菌直投式发酵剂的方法 技术领域 本发明涉及微生物领域，更具体的说，是涉及一种常温下制备乳酸菌直投式发酵剂的方法。 背景技术 由于发酵酸奶具有丰富的营养价值和良好的保健功能，以及我国人民消费水平的提高和健康理念的流行，近年来酸奶产销量呈迅猛增长之势，以平均每年25%的速度在增长，己经成为我国第一大发酵乳制品。而我国发酵酸奶产品中，有80%以上的酸奶使用的发酵剂是浓缩型冻干发酵剂。由于酸奶发酵剂绝大多是采用冷冻干燥的方法制备，冷冻干燥制备发酵剂过程较为繁琐，冷冻干燥所需的设备的投资和运转费用高，能耗大，冻干过程时间长（典型的冻干周期至少需要20 h以上），所以产品成本很高，不利于工业化生产。而且，冷冻干燥方法容易造成菌体细胞的损失而影响菌体的活性。 同时，虽然国内在冻干酸奶发酵剂的研究上已经发展了30多年，投入了大量的人力和物力，但是仍没有取得突破。因此，酸奶发酵剂绝大部分是购自国外知名的发酵剂公司，导致发酵剂市场被国外企业垄断，平均售价高达500万元/吨，而我国每年引进发酵剂的使用量在300吨左右，在引进酸奶发酵剂的费用高达15亿元。由于我国乳品加工企业均采用的是进口直投式酸奶发酵剂，生产成本较高（吨发酵乳产品发酵剂成本在200元以上），限制了直投式酸奶发酵剂在中、小型乳品企业的使用。 因此，寻找一种过程简单，成本低，适合我国国情的新型制备乳酸菌发酵剂的方法成为当务之急。 发明内容 本发明是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种制备过程简单，成本低廉，具有很高的生物量和活性，并能够实现工业化的常温下制备乳酸菌直投式发酵剂的方法。 本发明通过下述技术方案实现： 一种常温下制备乳酸菌直投式发酵剂的方法，其特征在于，包括下述步骤： （1）乳酸菌直投式发酵剂载体的制备：将去皮的馒头块上添加乳糖和甘油作为保护剂，然后121℃高压蒸汽灭菌30min，之后，于37℃烘干作为载体备用； （2）将乳酸菌菌悬液在无菌条件下包被到步骤（1）得到的载体上，直到载体饱和为止，制得包被好菌种的乳酸菌发酵剂； （3）将步骤（2）中的制得的包被好菌种的乳酸菌发酵剂室温无菌鼓风干燥，得到乳酸菌直投式发酵剂。 乳糖的质量添加量为馒头质量的1%-5%，甘油的体积添加量为馒头质量的1%-5%。 步骤（2）中的乳酸菌为瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌中的任一种。上述菌种均可以商购得到或采用常规的方法制备得到。其中，瑞士乳杆菌可具体采用TS206(Lactobacillus helveticus TS206)，瑞士乳杆菌6024等；保加利亚乳杆菌可采用保加利亚乳杆菌1.1480，保加利亚乳杆菌NCFB2772等；嗜热链球菌可采用嗜热链球菌6038，嗜热链球菌6217等。 当使用瑞士乳杆菌时，制备瑞士乳杆菌菌悬液的方法为：将瑞士乳杆菌菌种接种在由乳清粉、葡萄糖、酵母粉和水组成的乳清改良培养基中，置于37℃培养箱中培养24小时；之后将发酵液于常温下1500rpm×20min离心，弃去上清液，获取沉淀，即得到瑞士乳杆菌菌体；最后用无菌生理盐水稀释瑞士乳杆菌菌体，得到菌体浓度≥109cfu/ml的瑞士乳杆菌菌悬液；其中，乳清改良培养基中按质量百分比：乳清粉为10%，葡萄糖为0.5%，酵母粉为0.5%，余量的水。 将步骤（3）得到乳酸菌直投式发酵剂进行碾压粉碎，然后将粉碎后的乳酸菌发酵剂过20-40目的筛网，得到粒度均匀的乳酸菌直投式发酵剂。 本发明具有下述技术效果： 1、本发明的方法中，在馒头载体上添加了乳糖和甘油等保护剂，同时，馒头本身含有丰富的淀粉和蛋白质对乳酸菌具有很好的保护作用。另外，在制备直投式发酵剂的过程中，菌体没有采用冷冻干燥而是采自然干燥的方法，避免了冷冻伤害，因此，所得发酵剂具有很高的菌存活率、活性和生物量。发明中乳酸菌菌初始浓度≥109cfu/ml，用馒头作为载体所制备的发酵剂中菌含量可达到108cfu/g以上，发酵剂菌体存活率能达到60%以上，活性很高，室温储藏一个月后，凝乳时间几乎没有损失。 2、本发明中采用的馒头载体本身具有蜂窝状的结构，一方面容易吸附包被菌体，一方面也很容易干燥。整个干燥过程在12个小时之内就可以完成，制备方法快速、简单易行。 3、本发明的方法将我国传统食品馒头作为乳酸菌的载体，即将乳酸菌菌悬液吸附到灭菌的馒头载体上，然后将含有乳酸菌的馒头在室温下无菌烘干，最后粉碎制粉，无需贵重的器械，投资小，能耗很低，极大的降低了生产成本。 4、本发明的方法所采用的培养瑞士乳杆菌的乳清培养基中增加了酵母粉和葡萄糖，为瑞士乳杆菌的生长提供了必要的生长因子和碳源。通过该培养基培养的瑞士乳杆菌菌体浓度能够达到109cfu/ml。 具体实施方式 以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。 权利要求中的乳糖和甘油的添加量为1-5%，三个实施例中应该有1%、3%、5%附近的数值来支持权利要求。 实施例1 （1）用乳清培养基制备瑞士乳杆菌菌体： 按质量百分比将10%乳清粉、0.5%葡萄糖、0.5%的酵母粉、余量的水混合制成乳清改良培养基。 将瑞士乳杆菌TS206(Lactobacillus helveticus TS206)菌种接种在上述乳清改良培养基中，置于37℃培养箱中培养24小时。之后将发酵液于常温下1500rpm×20min离心，弃去上清液，获取沉淀，得到瑞士乳杆菌菌体，用生理盐水稀释瑞士乳杆菌菌体，制成菌体浓度为109cfu/ml的菌悬液，4℃冰箱保存备用。 （2）馒头载体的制备：将馒头去皮，并切成2×2×2cm3的块状，之后在去皮的馒头块上通过滴加的方式添加乳糖和甘油，馒头：质量百分比浓度为50%的乳糖溶液：甘油为100g：4ml：3.5ml，在 121℃高压蒸汽灭菌30min，灭菌结束后放置于37℃烘箱烘干作为载体备用。 （3）将步骤（1）中得到的备用的瑞士乳杆菌菌悬液直接包被到步骤（2）中得到的馒头载体上，直到馒头载体饱和为止，制得包被瑞士乳杆菌的发酵剂。 （4）将步骤（3）中的制得的包被瑞士乳杆菌的发酵剂室温无菌鼓风干燥12小时，完全干燥后得到瑞士乳杆菌直投式发酵剂。 （5）将步骤（4）中制备的干燥的瑞士乳杆菌直投式发酵剂碾压破碎，过20-40目的筛网，得到粒度均匀的瑞士乳杆菌直投式发酵剂粉剂成品。 （6）瑞士乳杆菌直投式发酵剂中菌含量的测定：首先称取步骤（5）制得的瑞士乳杆菌直投式发酵剂菌粉1g放入10ml 10%的无菌乳清培养基中，20℃复水30min，用生理盐水梯度稀释后用MRS固体培养基双层平板混菌计数，最后测得瑞士乳杆菌的浓度约为108cfu/g，发酵剂菌体存活率能达到60%以上，活性很高，室温储藏一个月后，凝乳时间几乎没有损失。 （7）利用制备的瑞士乳杆菌发酵剂制备酸奶：取100ml鲜奶，加入4g蔗糖，100℃杀菌15min，取步骤（5）中制得的瑞士乳杆菌直投式发酵剂粉剂2g添加到奶中，摇匀，37℃发酵8小时，待发酵乳凝乳后，放入4℃冰箱后熟12小时，制得酸奶。利用制备的瑞士乳杆菌发酵剂制得的酸奶凝乳良好，酸度适中,质地粘稠，口感细腻。 实施例2 （1）用MRS培养基制备保加利亚乳杆菌菌体： 将保加利亚乳杆菌（保加利亚乳杆菌1.1480）菌种接种在MRS培养基中37℃培养24小时，之后将发酵液于常温下3000rpm×30min离心，弃去上清液取沉淀得到保加利亚乳杆菌菌体，用生理盐水稀释保加利亚乳杆菌菌体，制成菌体浓度为1010cfu/ml的菌悬液，4℃冰箱保存备用。 （2）馒头载体的制备：将馒头去皮，并切成2×2×2cm3的块状，之后在去皮的馒头块上通过滴加的方式添加乳糖和甘油，馒头：质量百分比浓度为50%的乳糖溶液：甘油为100g：6ml：1.5ml，在 121℃高压蒸汽灭菌30min，灭菌结束后放置于37℃烘箱烘干作为载体备用。 （3）将步骤（1）中得到的备用的保加利亚乳杆菌菌悬液采用滴加的方式直接包被到步骤（2）中得到的馒头载体上，直到馒头载体饱和为止，制得包被保加利亚乳杆菌的发酵剂。 （4）将步骤（3）中的制得的包被保加利亚乳杆菌的发酵剂室温无菌鼓风干燥12小时，完全干燥得到保加利亚乳杆菌直投式发酵剂。 （5）将步骤（4）中制备的干燥的保加利亚乳杆菌直投式发酵剂碾压破碎，过20-40目的筛网，得到粒度均匀的保加利亚乳杆菌直投式发酵剂粉剂成品。 （6）保加利亚乳杆菌直投式发酵剂中菌含量的测定：首先称取步骤（5）制得的保加利亚乳杆菌直投式发酵剂菌粉1g放入10ml无菌MRS培养基中，20℃复水30min，用生理盐水梯度稀释后用MRS固体培养基平板混菌计数，最后测得保加利亚乳杆菌的浓度约为109cfu/g，发酵剂菌体存活率能达到65%以上，活性很高，室温储藏一个月后，凝乳时间几乎没有损失。 （7）利用制备的保加利亚乳杆菌发酵剂制备酸奶：取100ml鲜奶，加入4g蔗糖，100℃杀菌15min，取步骤（5）中制得的保加利亚乳杆菌直投式发酵剂粉剂2g添加到奶中，摇匀，37℃发酵8小时，待发酵乳凝乳后，放入4℃冰箱后熟12小时，制得酸奶。利用制备的保加利亚乳杆菌发酵剂制得的酸奶凝乳效果很好，奶香浓郁。 实施例3 （1）用MRS培养基制备嗜热链球菌菌体： 将嗜热链球菌（嗜热链球菌6038）菌种接种在MRS培养基中，37℃培养24小时，之后将发酵液于常温下3000rpm×30min离心，弃去上清液取沉淀得到嗜热链球菌菌体，用生理盐水稀释嗜热链球菌菌体，制成菌体浓度为1010cfu/ml的菌悬液，4℃冰箱保存备用。 （2）馒头载体的制备：将馒头去皮，并切成2×2×2cm3的块状，之后在馒头块上通过滴加的方式添加乳糖和甘油，馒头：质量百分比浓度为50%的乳糖溶液：甘油为100g：5ml：3ml，在 121℃高压蒸汽灭菌30min，灭菌结束后放置于37℃烘箱烘干作为载体备用。 （3）将步骤（1）中得到的备用的嗜热链球菌菌悬液采用滴加的方式直接包被到步骤（2）中得到的馒头载体上，直到馒头载体饱和为止，制得包被嗜热链球菌的发酵剂。 （4）将步骤（3）中的制得的包被嗜热链球菌的发酵剂室温无菌鼓风干燥12小时，完全干燥得到嗜热链球菌直投式发酵剂。 （5）将步骤（4）中制备的干燥的嗜热链球菌直投式发酵剂碾压破碎，过20-40目的筛网，得到粒度均匀的嗜热链球菌直投式发酵剂粉剂成品。 （6）嗜热链球菌直投式发酵剂中菌含量的测定：首先称取步骤（5）制得的嗜热链球菌直投式发酵剂菌粉1g放入10ml无菌MRS培养基中，20℃复水30min，用生理盐水梯度稀释后用MRS固体培养基平板混菌计数，最后测得嗜热链球菌的浓度约为109cfu/g，发酵剂菌体存活率能达到65%以上，活性很高，室温储藏一个月后，凝乳时间几乎没有损失。 （7）利用制备的嗜热链球菌发酵剂制备酸奶：取100ml鲜奶，加入4g蔗糖，100℃杀菌15min，取步骤（5）中制得的嗜热链球菌直投式发酵剂粉剂2g添加到奶中，摇匀，37℃发酵8小时，待发酵乳凝乳后，放入4℃冰箱后熟12小时，制得酸奶。利用制备的嗜热链球菌发酵剂制得的酸奶凝乳效果良好，奶香浓郁。 本发明所采用的常温下制备乳酸菌直投式发酵剂的方法，可应用于多种乳酸菌直投式发酵剂的生产中，具有很强的推广价值。
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 一.目的： 提供一种制备过程简单，成本低廉，具有很高的生物量和活性，能够实现工业化的制备乳酸菌直投式发酵剂的方法。 二.基本思路： 在去皮的馒头块上添加乳糖和甘油作为保护剂，灭菌烘干后作为载体；将乳酸菌菌悬液在无菌条件下包被到馒头载体上，制得包被好菌种的乳酸菌发酵剂；将包被好菌种的乳酸菌的发酵剂室温无菌鼓风干燥，得到乳酸菌直投式发酵剂。 三.创新点： 1.本发明的方法将我国传统食品馒头作为乳酸菌的载体，即将乳酸菌菌悬液吸附到灭菌的馒头载体上，然后将含有乳酸菌的馒头在室温下无菌烘干，最后粉碎制粉，无需贵重的器械，投资小，能耗很低，极大的降低了生产成本。 2.本发明方法不仅可以生产瑞士乳杆菌直投式发酵剂，同样适用于保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等发酵剂的研发与生产，适应范围广，具有良好的推广前景。 四.技术关键： 1.乳酸菌直投式发酵剂载体的制备：乳糖的质量添加量为馒头质量的1%-5%，甘油的体积添加量为馒头质量的1%-5%。 2.乳清改良培养基中按质量百分比：乳清粉为10%，葡萄糖为0.5%，酵母粉为0.5%，余量的水。 五．主要技术指标： 发明中乳酸菌菌初始浓度≥109cfu/ml，用馒头作为载体所制备的发酵剂中菌含量可达到108cfu/g以上，发酵剂菌体存活率能达到60%以上，活性很高，室温储藏一个月后，凝乳时间几乎没有损失。
科学性、先进性
- 1.本发明的方法将我国传统食品馒头作为乳酸菌的载体。 馒头载体本身具有蜂窝状的结构，一方面容易吸附包被菌体，一方面也很容易干燥。整个干燥过程在12个小时之内就可以完成且在馒头载体上添加了乳糖和甘油等保护剂，同时，馒头本身含有丰富的淀粉和蛋白质对乳酸菌具有很好的保护作用。过程简单，大大降低了制备成本。 2.本发明方法在制备直投式发酵剂的过程中，菌体没有采用冷冻干燥而是采用常温自然干燥的方法，避免了冷冻伤害。因此，所得发酵剂具有很高的菌存活率、活性和生物量。 而我国发酵酸奶产品中，有80%以上的酸奶使用的发酵剂是浓缩型冻干发酵剂。冷冻干燥所需的设备的投资和运转费用高，能耗大，冻干过程时间长，所以产品成本很高，不利于工业化生产。而且，冷冻干燥方法容易造成菌体细胞的损失而影响菌体的活性。 因而，本发明应我国当务之急，克服了现有技术中的不足之处，提供了一种制备过程简单，成本低廉，具有很高的生物量和活性，并能够实现工业化的常温下制备乳酸菌直投式发酵剂的方法。适合我国国情。
获奖情况及鉴定结果
- 获我校第十一届挑战杯大学生课外学术科技作品竞赛一等奖
作品所处阶段
- 实验室阶段
技术转让方式
- 专利
作品可展示的形式
- 实物、产品
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 一.使用说明（以下均以瑞士乳杆菌直投式发酵剂为例）： 取100ml鲜奶，加入4g蔗糖，100℃杀菌15min，取瑞士乳杆菌直投式发酵剂粉剂2g添加到奶中，摇匀，37℃发酵8小时，待发酵乳凝乳后，放入4℃冰箱后熟12小时，制得酸奶。 二．技术特点和优势： 1.本发明的方法过程简单，从而极大地降低了制备酸奶发酵剂的成本。 2.本发明的方法适应范围广，不仅可以用于国内外各大、中、小乳品企业生产酸奶，而且厂商可以直接将利用此方法制备的乳酸菌直投式发酵剂推向市场。 三．适用范围： 1.国内外各大、中、小乳品企业都可以利用本发明的制备乳酸菌直投式发酵剂的方法生产酸奶。 2.此发酵剂亦可推广到每户人家，使每个人都可以按照自己的作息时间方便快捷地制作新鲜的酸奶。 四．市场分析及经济效益预测： 1.市场分析：益生菌作为一种抗病强身的新型保健食品无疑将拥有良好的发展前景。 2.经济效益分析：本发明的方法极大地降低了酸奶发酵剂的制备成本，亦降低了酸奶的成本，从而扩大了市场中对酸奶的需求。
同类课题研究水平概述
- 20世纪90年代，科学家发现瑞士乳杆菌(Lactobacus helveticus)发酵乳中的短肽具有抑制血管紧张素转化酶、缓解紧张、改善睡眠、增强记忆力、提高更年期女性血钙浓度等多种功能。瑞士乳杆菌已在国外列入益生菌的行列。芬兰VALIO乳品公司投放了名为“EVOLUS”的瑞士乳杆菌发酵乳。该产品经过临床试验证明具有显著的缓解原发性高血压作用，被美国食品技术(Journal of FoodTechnology)评价为10大功能性食品之一。日本CALPIS公司应用瑞士乳杆菌和啤酒酵母开发了冷藏酸乳、酸乳饮料、含乳碳酸饮料以及片剂和胶囊等功能食品。 本实验室自2000年开始从事瑞士乳杆菌高表达具有抗血压升高肽的研究与开发，获得了一批研究成果。如郭宇星、张莹、梁美艳的研究成果。 我国发酵酸奶产品中，有80%以上的酸奶使用的发酵剂是浓缩型冻干发酵剂。由于酸奶发酵剂绝大多是采用冷冻干燥的方法制备，冷冻干燥制备发酵剂过程较为繁琐，冷冻干燥所需的设备的投资和运转费用高，能耗大，冻干过程时间长（典型的冻干周期至少需要20 h以上），所以产品成本很高，不利于工业化生产。而且，冷冻干燥方法容易造成菌体细胞的损失而影响菌体的活性。 同时，虽然国内在冻干酸奶发酵剂的研究上已经发展了30多年，投入了大量的人力和物力，但是仍没有取得突破。因此，酸奶发酵剂绝大部分是购自国外知名的发酵剂公司，导致发酵剂市场被国外企业垄断，平均售价高达500万元/吨，而我国每年引进发酵剂的使用量在300吨左右，在引进酸奶发酵剂的费用高达15亿元。由于我国乳品加工企业均采用的是进口直投式酸奶发酵剂，生产成本较高（吨发酵乳产品发酵剂成本在200元以上），限制了直投式酸奶发酵剂在中、小型乳品企业的使用。 因此，寻找一种过程简单，成本低，适合我国国情的新型制备乳酸菌发酵剂的方法成为当务之急。
