基本信息
- 项目名称：
- 四种临床应用材料对牙龈成纤维细胞的毒性研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 体外试验表明，现今临床口腔修复合金材料释放出的金属离子存在抑制细胞增殖等毒性作用的缺陷。本实验通过MTT比色法测镍铬、钴铬、金钯合金、氧化锆四种材料吸光度值，计算细胞相对增殖率。并通过流式细胞仪法测定不同材料浸提液中培养的人牙龈成纤维细胞不同增殖周期时相的DNA百分含量，计算细胞的增殖指数百分比，最终得出此4种材料的细胞毒性大小，发现氧化锆对牙龈细胞损伤最小，很好地解决了合金材料对牙龈损伤的问题。
- 详细介绍：
- 镍铬合金、钴铬合金、金钯合金、氧化锆（烤瓷）作为临床口腔修复领域最常用的材料，对其生物相容性的研究在口腔修复学和材料学中始终占有十分重要的地位。很多研究发现，合金在口腔中可以析出金属离子，在戴用含合金修复体患者的唾液、口腔软组织(如牙龈、舌刮片)中检测到相关金属离子浓度升高。体外试验表明，牙科合金释放出的金属离子具有降低细胞代谢、抑制细胞增殖等毒性作用。本实验选择国内十多家加工厂常用的4种德国进口铸造合金，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测法和流式细胞仪测量法，检测并比较其对人牙龈成纤维细胞的毒性作用，选出最为优越的口腔修复材料。 本实验采用材料及试剂为：镍铬合金、钴铬合金、金钯合金、氧化锆（烤瓷）（Germany），人牙龈成纤维细胞HGF（ATCC，USA）；96孔板、细胞培养瓶（NUNC，丹麦）；胰蛋白酶、DMEM（高糖）培养基、RPMI-1640培养基、双抗、胎牛血清FBS等均为美国Thermo Scientific HyClone产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司； 无水乙醇、饱和酚（平衡酚、tris-Hcl）等化学试剂均为国产分析纯。 主要仪器和设备为：酶标仪（Thermo electron corporation，USA）；倒置显微镜（Nikon，日本）；CO2孵箱（Thermo Lab systems，USA）；低速离心机（科大创新），流式细胞仪（BD，USA）。 具体实验方法如下: 1.铸造合金浸提液的制备 将4种合金铸造成直径6 mm,高3 mm的圆柱体,每种合金10个试样。用蒸馏水超声波清洗10 min,于高温高压(103. 42kPa、121℃)条件下灭菌处理20 min。按细胞培养液(浸提介质)与试样表面积之比为1 ml/cm2的标准在37℃、5% CO2、湿度95%的无菌条件下浸提72 h作为浸提液。 2 人牙龈成纤维细胞HGF传代培养 利用含10%胎牛血清的DMEM，加双抗（100u/ml青霉素、100u/ml链霉素）培养HGF。在CO2孵箱中，在37℃、5% CO2、湿度95%的无菌条件下培养2-3天，根据细胞的生长情况及培养液的颜色变化换液, 待培养基变为黄色，细胞铺满瓶底90%后传代。去掉原培养瓶中的培养基，用无血清培养基缓慢清洗培养瓶中细胞，加1ml胰蛋白酶消化，置于孵箱中1-2min,用等量的培养基中和，并用加液枪吹打，将细胞吹打下来。将液体抽取出置于离心管中，以1000r/min离心10min。去掉上清液，加入2ml培养基吹打均匀，将含有细胞的培养液平均分在两个培养瓶中，再在每个培养瓶中分别加入2ml培养基，放入CO2孵箱中培养（整个过程无菌操作）。 3 MTT比色法检测临床应用材料对牙龈成纤维细胞的毒性 将实验分为阴性对照组、阳性对照组、镍铬合金、金铂合金组(含89.4%黄金)、钴铬合金组、氧化锆全瓷组,每组6复孔。每孔内分别接种细胞悬液(密度为3000个/m1) 100μl，以含10%胎牛血清FBS的DMEM培养液作为阴性对照,在37℃、5% CO2、湿度95%条件下培养24 h，使细胞贴壁生长。用含50%材料浸提液的新鲜培养液交换试管中原培养液,阴性对照以新鲜培养液交换,阳性对照组加入8 ml/L的苯酚溶液10μl。分别在37℃条件下继续培养至2、4、7 d，每孔加入10μl MTT(5 mg/ml)溶液,置于37℃、饱和湿度、5% CO2恒温培养箱培养4h后取出,倒出96孔板中的液体，加入DMSO溶解。用酶标检测仪在492nm波长下测定各孔吸光度(A)值,并计算细胞相对增殖率(relative growth rate, RGR)，公式:RGR=(实验组A值/阴性对照组A值)×100%。根据RGR值评定材料毒性程度级别。 结论：MTT实验方法只是通过检测线粒体的一种酶的活性变化来评估材料的细胞毒性，并不反映细胞其它功能状况。从MTT比色法结果分析，细胞增殖指数依次为镍铬合金、钴铬合金、金钯合金、氧化锆（烤瓷），氧化锆组对牙龈成纤维细胞的损伤率最小。而镍铬合金组在后四组材料浸提液组中对牙龈成纤维细胞的损伤率最大，但均比阳性对照组的损伤率小。 4 流式细胞仪法（FCM）检测临床应用材料对牙龈成纤维细胞的毒性 取细胞悬液(密度为1×105个/ml)3 ml加入45 ml培养瓶中37℃培养72 h，使细胞生长进入旺盛期。以含50%四种临床应用材料浸提液的新鲜培养液交换瓶内液体,阳性对照组加入含300μl饱和酚培养液,继续培养2d。中止培养。 （1）用无血清1640培养基清洗2次（瓶内细胞），洗去细胞碎片。 （2）用胰酶彻底消化（使细胞分散成单个，无细胞团）再用等量的培养基中和，离心（800r/min，5min）。 （3）离心后去除上清液，再用无血清的1640培养基3ml洗两次（吹打，离心）。 （4）离心后去除上清液，留500μl 1640培养基用200μl的抢缓慢混匀。 （5）缓慢加5ml的4℃预冷75%的乙醇，则得到浓度为70%-75%之间的浓度，再用500μl的抢混匀（7次左右）。利用流式细胞仪试剂盒采用流式细胞仪测定细胞各增殖周期时相的DNA百分含量。 细胞增殖指数=(S+G2M) /(G0G1+S+G2M)。 结论：流式细胞仪法从分子水平评价合金的细胞毒性,镍铬合金的增殖指数最小，对牙龈成纤维细胞HGF的损伤程度最大；而氧化锆（烤瓷）组的增殖指数最大对牙龈成纤维细胞HGF的损伤程度最小。 MTT比色法和流式细胞仪检测结果均提示氧化锆抑制率最小，而镍铬合金的抑制指数最大；镍铬合金的细胞毒性略大于另三种材料，但均在临床应用的允许范围内。 本实验的意义在于：现如今合金材料广泛地用于牙科的冠桥修复、可摘局部义齿支架和烤瓷牙的基底金属。但由于其具有潜在的毒性和致癌性，越来越多的学者对合金的生物相容性提出质疑。本实验通过选择4种临床应用材料和人牙龈成纤维细胞进行细胞毒性试验，利用MTT比色法及流式细胞仪法(FCM)验证并评价4种材料的细胞毒性，证明氧化锆陶瓷材料对牙龈细胞损伤最小，本实验使体外细胞培养对机体内环境的模拟更趋真实，试验结果更为准确与客观。有研究表明氧化锆具有密度高强度高的特点，抗破裂性及破裂后强韧的固化性能，是一种优秀的高科技生物材料，生物相容性好，优于各种金属合金，包括黄金。氧化锆对牙龈无刺激、无过敏反应，很适合应用于口腔，避免了金属在口腔内产生的过敏、刺激、腐蚀等不良反应，弥补了合金材料对牙龈损伤的缺点，此实验项目为氧化锆在口腔修复应用中的安全性提供了可靠的依据。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 镍铬合金、钴铬合金、金钯合金、氧化锆（烤瓷）为临床口腔修复领域最常用的材料。研究发现，合金在口腔中可以析出金属离子，同时体外实验表明释放出的金属离子具有降低细胞代谢、抑制细胞增殖等毒性作用。本实验选择4种德国进口铸造合金，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测法和流式细胞仪测量法，检测和比较四种合金对人牙龈成纤维细胞的毒性作用，为临床选择高安全性铸造合金提供实验支持。
科学性、先进性及独特之处
- 镍铬合金、钴铬合金、金钯合金、氧化锆为口腔修复领域最常用的临床材料，口腔内这4种材料析出的金属离子直接与牙龈接触，而用人牙龈成纤维细胞进行这4种临床应用材料进行细胞毒性试验报道较少见。本研究选择此4种材料和上述细胞进行细胞毒性试验，使体外细胞培养对机体内环境的模拟更趋真实，实验结果更为准确与客观。利用MTT比色法及流式细胞仪法进一步验证来评价4种材料的细胞毒性，以选择出临床更为安全的材料。
应用价值和现实意义
- 氧化锆陶瓷材料是目前使用较广的一种全瓷口腔修复材料，它具有密度高强度高的特点，具有抗破裂性及破裂后强韧的固化性能。并且它是一种优秀的高科技生物材料，生物相容性好，优于各种金属合金，包括黄金。氧化锆对牙龈无刺激、无过敏反应，很适合应用于口腔，避免了金属在口腔内产生的过敏、刺激、腐蚀等不良反应。本实验应用细胞学方法在细胞水平证明了氧化锆陶瓷材料的优越性，为其作为口腔修复材料提供更广阔的前景。
学术论文摘要
- 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法，测定人牙龈成纤维细胞在镍铬合金、钴铬合金、金钯合金、氧化锆（烤瓷）4种临床应用材料的浸提液中培养不同时间（2、4、7天）的吸光度值，计算细胞的相对增殖率(RGR)；并采用流式细胞仪法测定以上四种材料浸提液中培养的人牙龈成纤维细胞不同增殖周期时相中DNA相对百分含量，计算细胞的增殖指数百分比。意在检测镍铬合金、钴铬合金、金钯合金、氧化锆（烤瓷）4种临床应用材料的细胞毒性。通过上述两种方法测定4种合金对牙龈成纤维细胞毒性结果的比较，发现氧化锆（烤瓷）对牙龈细胞损伤最小，证明其具有良好的生物相容性及安全性等优于其他合金的性能，很好地解决了合金材料对牙龈损伤这一难题，为其作为口腔修复材料提供了更广阔的前景。
获奖情况
- 本实验获得大连医科大学第五届大学生课外学术科技作品大赛 二等奖
鉴定结果
- 本实验为作者及合作者独立完成，构思新颖，实验精巧，数据真实可信，且具有极强的现实意义。
参考文献
- 四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测法和流式细胞仪测量法检测和比较其对人牙龈成纤维细胞的毒性作用 Scott A，Egner W，Gawkrodger DJ，et a1．The national survey of adverse reactions to dental materials in the UK：A preliminary study by the UK Adverse Reactions Reporting Project[J]．Br Dent J，2004，196(8)：471—477． Faccioni F，Franceschetti P，Cerpelloni M，et a1．In vivo study on metal release from fixed orthodontic appliances and DNA damage in oral mucosa cells[J]．Am J Orthod Dentofacial Orthop，2003，124(6)：687—693 张帼，黄翠，张智星，等．牙本质粘结剂对人牙髓细胞毒性的体外研究.实用口腔医学杂志，2005，21：808 吴建红，文辉，赵刚，等．含关木通血清对人肾小管上皮细胞增殖周期的影响．医药导报，2007，26：1134
同类课题研究水平概述
- 从20世纪90年代起越来越多学者根据材料植入体内的不同部位及不同的应用目的，选择不同部位和组织来源的细胞作为试验细胞。镍铬合金、钴铬合金、金钯合金、氧化锆（烤瓷）4种口腔修复领域最常用的临床材料，口腔内这4种材料析出的金属离子直接与牙龈接触，而用人牙龈成纤维细胞进行这4种临床应用材料进行细胞毒性试验报道较少见。镍铬合金广泛地用于牙科的冠桥修复、可摘局部义齿支架和烤瓷牙的基底金属。由于镍和镍化合物都有潜在的毒性和致癌性，越来越多的学者对镍的生物相容性提出质疑Faccioni等发现，在戴固定矫治器的患者颊黏膜中，镍和铬的浓度分别是正常人的3.4和2.8倍，金属浓度和口腔黏膜细胞活力有明显的负相关。而氧化锆陶瓷材料是目前使用较广的一种全瓷口腔修复材料，它具有密度高强度高的特点，具有抗破裂性及破裂后强韧的固化性能。并且它是一种优秀的高科技生物材料，生物相容性好，优于各种金属合金，包括黄金。现有研究表明氧化锆对牙龈无刺激、无过敏反应，很适合应用于口腔，避免了金属在口腔内产生的过敏、刺激、腐蚀等不良反应。 本实验基于以上国内外研究成果，利用MTT及流式细胞仪法，采用以上四种应用普遍的临床口腔修复应用材料对人牙龈成纤维细胞进行细胞毒性试验探究。
