基本信息
- 项目名称：
- 快速诊断副猪嗜血杆菌的PCR检测试剂盒的研究与应用
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究的目的在于：建立副猪嗜血杆菌早期PCR诊断方法，并以此为基础研制早期诊断试剂盒。实现在感染早期（菌血症时期）对该病原菌的准确诊断，以指导临床上早期给药治疗，有效降低该病的发病率与死亡率。
- 详细介绍：
- 副猪嗜血杆菌所致疾病是近年来严重危害养猪业发展的细菌性传染病, 在健康猪群中呈暴发性流行,HPS宿主性很强，只感染猪，感染猪主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄，可以影响从2周龄到4月龄的生长猪，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达50％，对全球的养猪业带来巨大的经济损失。副猪嗜血杆菌主要引起多发性浆膜炎、关节炎和胸膜炎等，目前的检测方法只能在感染中后期确诊该病，且多数临床药物无法在浆膜形成有效浓度，因而治疗效果极差。本研究的目的在于：在建立副猪嗜血杆菌早期PCR诊断方法的基础上，研制出诊断试剂盒用于副猪嗜血杆菌的早期诊断，在感染初期（菌血症时期）对该病原菌进行准确诊断，以指导早期给药治疗，降低该病的发病率与死亡率。 本试验是基于Hps的外膜蛋白（omp）基因设计一对特异性扩增引物，预扩增片段是414bp，建立的一种更加特异，对模板要求更低的PCR检测方法，通过各种条件优化，研制成标准化检测试剂盒。具体思路如下： 根据GenBank中已发布Hps外膜蛋白（omp）基因设计一对特异性扩增引物，预扩增片段是414bp。以试验室保存的Hps血清4型标准菌株制备细菌基因组模板，通过PCR扩增得到与预扩增片断大小相符414bp左右目的条带，回收测序，并通过BLAST与GenBank中已发布序列进行比对，建立特异PCR检测方法。通过人工感染健康仔猪，感染后不同时期采集鼻腔拭子与血液样本进行临床样品检测，以确定该方法用于Hps早期感染的可行性；同时检测结果还可初步探索分析副猪嗜血杆菌的排毒规律，为制定了合理的检测程序及疾病控制提供参考。 在此基础上，进一步对各项条件优化，并通过敏感性、可重复性、特异性、稳定性和保存条件等研究，为研制针对Hps早期感染的标准化检测试剂盒。在试验室检测的基础上，进行临床样品的检测，验证试剂盒用于生产的可行性，并与文献中已报道的副猪嗜血杆菌试剂盒进行比较。 本试验的关键在于特异性引物的设计和目的片段扩增；Hps感染模型的复制及早期PCR检测方法的建立；试剂盒的标准化研究；临床样本的检测及同类技术比较。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 本研究的目的在于：建立副猪嗜血杆菌早期PCR诊断方法，并以此为基础研制早期诊断试剂盒。实现在感染早期（菌血症时期）对该病原菌的准确诊断，以指导临床上早期给药治疗，有效降低该病的发病率与死亡率。 本试验的关键在于特异性引物的设计和目的片段扩增；Hps感染模型的复制及早期PCR检测方法的建立；试剂盒的标准化研究；临床样本的检测及同类技术比较。
科学性、先进性及独特之处
- 1、本试验最大的创新点在于建立了一种灵敏的副猪嗜血杆菌PCR诊断方法，并在此基础上研制了相应的试剂盒,能够在感染初期（菌血症时期）对该病原进行准确诊断，以指导早期给药治疗，降低该病的发病率与死亡率。 2、本试验还选取我国副猪嗜血杆菌多种流行血清型进行该PCR检测试剂盒的测试，均能扩增出414bp左右的目的条带，此试剂盒在国内可进行推广。 3、方法简便可行，与同类技术比较有较高实用性。
应用价值和现实意义
- 本试验建立的诊断方法弥补了目前诊断方法的不足，实现了早期诊断，在此基础上研制的试剂盒使用方便、特异性强、灵敏度高、可重复性和稳定性好，可以批量生产，以便用于临床上早期诊断。通过进行临床样品的检测和同类技术比较试验，说明本试验研制的试剂盒比现有文献报道的试剂盒检测阳性率更高，样品的保存方法更合理，并且通过探索副猪嗜血杆菌的排毒规律，确定了临床上感染的最佳检测时间，使该试剂盒能够在生产中推广普及。
学术论文摘要
- 目的 建立副猪嗜血杆菌早期诊断方法，从而研制早期检测试剂盒，并进行初步应用。方法 根据GenBank中已发布Hps外膜蛋白（omp）基因设计一对特异性扩增引物，预扩增片段为414bp；在此基础上进行试剂盒的研制，并通过敏感性、可重复性、特异性、精密性、稳定性和保存条件等研究，为实现该试剂盒的标准化提供参考；人工感染健康仔猪并设立对照，感染后不同时期采集鼻腔拭子与血液样本进行临床样品检测；通过采集四川境内同时出现呼吸症状和发烧症状的仔猪鼻腔分泌物和前腔静脉样品各300份，用本试验研制的试剂盒和现有文献报道的试剂盒进行检测。结果 设计的特异性引物扩增片段为414bp；试剂盒在活菌数大于425cfu/mL时能进行准确检测，批内和批间检测无差异，在—20℃条件下保存较为稳定；人工感染仔猪，在感染后2d~10d能够从鼻腔拭子检测到该菌感染，在感染后2d~4d血液中该菌的检测率高达100%；检测300份临床样品，结果显示，本试验研制的试剂盒阳性率明显高于现有文献报道的试剂盒。结论 本实验所研制的试剂盒敏感性高,特异性强，稳定性较好，能快速诊断Hps，为更好地预防、控制该病的发生提供技术保障。
获奖情况
- 1、四川农业大学第七届“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛终审决赛中获得特等奖 2、论文待发表
鉴定结果
- 论文待发表，暂无
参考文献
- [1] 张盼锋，仇微，等．副猪嗜血杆菌PCR快速诊断方法的建立[J]．广东畜牧兽医科技，2009，34(1)：33-34． [2] 林雪玲，黄耿森，冼琼珍，等．副猪嗜血杆菌分离鉴定与PCR检测方法的建立及应用[J]．吉林农业大学学报，2006，28(3)：321-323． [3] 万世平，王建，葛菲菲，等．副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用[J]．动物医学进展，2009，30(1)：9-12． [4] 万世平，卓国荣，姜法铭，等．副猪嗜血杆菌病诊断方法的研究进展[J]．养猪学报，2009，(6)：68-70． [5]KimJ，ChungH，JungT．Post weaning systemic wasting syndrome of pig sin Korea：prevalence，microscopic lesions and coexisting micro organisms[J ]．Vet Med Sci，2002，64：57-62． [6] Amano H，Shibata M，Kajio N，et a1．Pathologic observations of pigs intranasally inoculated with serovar1，4 and 5 of Heamophilus parasuis using immunoperoxidase method[J]．Vet Med Sci，1994，56(4)：639-644． [7]Kielstein P，Rapp—Gabrielson V J．Designation of 15 serovars ofttaemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion usingheat—stable antigen extracts[J]．Clin Microbiol，1992，30：826-865．
同类课题研究水平概述
- 副猪嗜血杆菌病是近年来严重危害养猪业发展的新发细菌性传染病，在健康猪群中呈暴发性流行，只感染猪，主要在断奶后和保育阶段发病，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达50％。在我国，Hps在各猪场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，目前常用的诊断方法主要有病原学和血清学方法。病原学方法主要是细菌的分离和鉴定，但是由于本菌对培养条件较为苛刻，且比较脆弱，从病料中分离率低。血清学方法主要有琼脂扩散试验、间接血凝试验、ELISA等，但血清学诊断结果不一致并且不准确。更重要的是上述方法只能在感染中后期确诊该病，多数临床药物无法在浆膜形成有效浓度，治疗效果极差。如果能在早期对该病进行确诊，早期给药，治愈率很高。所以，建立一种早期、快速、准确的诊断方法对生产具有重要意义。 本实验研究的PCR特异性扩增引物是根据根据GenBank中已发布的Hps外膜蛋白（omp）基因设计的，扩增片段为414bp，较之目前普遍使用的16S特异性引物（扩增片段为822bp），特异性更高，对模板要求更粗略，能检测到细菌浓度更低，即在活菌数大于425cfu/ml 时检测到清晰的目的条带，可用于在感染初期（菌血症时期）对Hps进行准确诊断，达到早期诊断的目的。在此方法基础上研制的试剂盒使用方便、灵敏度高、特异性强、可重复性和稳定性好。本研究对养猪业预防和控制副猪嗜血杆菌病具有较强的应用价值。 针对Hps在猪群中的广泛传播而对全球养猪业带来的巨大危害，国内外近年来也一直致力于对猪嗜血杆菌病的研究。目前，已取得了突破性进展，但仍不够成熟，各种检测技术尚存在一定的局限性，需要进一步的优化。 本研究通过与目前普遍使用的16S特异性引物相比较，设计一种特异性更强，对模板要求更加粗略的特异性引物，建立副猪嗜血杆菌PCR早期诊断方法，并研制出快速检测试剂盒，同时试剂盒进行标准化检测，使其能够在生产中得到推广应用。 今后的进一步研究可以建立在副猪嗜血杆菌排毒规律探索的基础之上，进行感染猪体温变化对检测阳性率的影响研究，以制定一套科学的临床检测程序，为本试剂盒的推广提供理论依据。
