基本信息
- 项目名称：
- AQP9在不同砷敏感性哺乳动物细胞中的表达比较
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- AQP是膜主体内在蛋白家族成员，目前在哺乳动物中已经发现11种AQP亚型，即AQP0-AQP10。它们在多种细胞膜上表达，作为通道蛋白参与细胞内外液体的转运。不同的家族成员其cDNA序列具有高度同源性，氨基端结构极其相似，提示其决定AQP家族功能的共性。已有大量的研究证实AQP9在砷的入胞机制中发挥重要作用，明确认为AQP9是负责细胞砷摄入的通道蛋白。
- 详细介绍：
- 1.项目实施情况；2.项目研究内容及方法的创新；3.项目成果的学术价值；4.项目成果的社会效益和经济效益；5.研究存在的不足或欠缺，尚需深入研究的问题等。1500字左右。 1项目实施情况：基本按项目内容实施。 2 研究内容： ① 培养对砷具有不同敏感性的细胞，MTT法检测其LC50； ② 检测对砷不同敏感性细胞内AQP9表达水平及磷酸化水平：RT-PCR检测不同敏感性细胞内AQP9 mRNA表达水平，Western-blot检测AQP9蛋白表达水平及其磷酸化水平。 ③ 分别用浓度2、4、8、16、32μM的砷加压培养砷不同敏感性细胞，不加砷处理的细胞作为对照，采用RT-PCR检测AQP9 mRNA表达水平，Western blot检测AQP9蛋白表达水平和磷酸化水平，原子荧光法测定细胞内砷含量。 ④ AQP9磷酸化位点突变对细胞内砷摄入的影响：对AQP9蛋白序列进行磷酸化位点分析，通过PCR扩增磷酸化位点突变的AQP9全长cDNA,构建入pcDNA3.1真核表达载体，转染进入AQP9基础表达较低的细胞中，Western blot检测AQP9表达水平和磷酸化水平，原子荧光法测定细胞内砷含量。 本项目所采用的技术方法均为国际上通用的分子生物学技术方法，其技术水平在本领域中应属前沿。 3 学术价值：为深入研究依赖于AQP9的砷摄入的分子机制奠定基础，对砷的中毒防治具有重要意义，也能让我们更好地利用它来治疗各种恶性疾病。 4 项目成果的社会效益：本项目作为深入研究依赖于AQP9的砷摄入的分子机制中的一部分，如何实验结果支持我们所提出的假设，证明AQP9的磷酸化确实调控细胞砷摄入水平，那我们今后可以开发AQP9磷酸化抑制剂类产品，来提高细胞对砷的敏感性，增强砷作为癌症治疗药物的效果，解决砷的临床耐药问题。本项目将为此类产品的开发提供理论支持。目前而言，尚无盈利能力，产品的成熟开发亦需时日。 5 存在的不足和需要深入研究的问题：本项目实施过程中还存在很多不足和缺陷，由于课程较多，用于项目研究的时间相对较少。另外，由于是初次接触科学研究，对于很多技术方法还不能熟练运用，花费了较多时间用于实验条件的摸索；另外也花了较多时间用于熟悉该领域的相关研究进展，因此实验进程较缓慢，有些结果还较为粗糙，需要进一步重复和验证。需要深入研究的问题是进一步明确AQP9的表达及磷酸化由哪种信号通路与蛋白或酶所调控，并且这种调控作用是否是直接强效的，对砷的摄入又产生了什么样的影响等等。
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撰写目的和基本思路
- 研究采用本实验室前期已经诱导得到ECV304抗砷细胞株、肝癌细胞株HepG2以及肝实质性细胞L-02为实验对象，采用荧光定量PCR和Western blotting对各种砷不同敏感性细胞中AQP9的RNA和蛋白表达水平进行比较分析，并采用同样的方法对加砷诱导后这四类细胞中AQP9的RNA和蛋白表达水平进行比较分析。以探讨AQP9在抗砷性细胞株中的表达水平与其抗砷性之间的关系，为阐述其机制奠定基础。
科学性、先进性及独特之处
- 研究证实AQP9是砷的入胞通道之一，其作用机制尚不明确。实验选取四种哺乳类细胞株，采用荧光定量PCR和Western blotting对砷不同敏感性细胞中AQP9的RNA和蛋白表达水平进行比较分析，并采用同样的方法对加砷诱导后这四类细胞中AQP9的RNA和蛋白表达水平进行比较分析。以探讨AQP9在抗砷性细胞株中的表达水平与其抗砷性之间的关系，为阐述其机制奠定基础。
应用价值和现实意义
- 砷几千年来作为药物治疗肿瘤等一些难治病有较为明确的疗效，但其临床使用所产生的耐药性是阻碍其使用的一个难题。本项目检测抗砷性细胞中AQP9的mRNA表达水平和蛋白表达水平，探讨AQP9对细胞抗砷性中的作用机制，为解决砷耐受性难题提供理论基础和潜在靶点。
学术论文摘要
- 目的：研究三氧化二砷（As2O3）对人ECV-304细胞株、抗砷性ECV-304（AsRE，本实验室前期低剂量砷诱导得到）细胞株、人肝癌细胞株HepG和人肝实质细胞株L-02的毒性影响，以及加砷处理后这四种细胞株中水通道蛋白AQP9 mRNA表达水平及蛋白表达水平的变化。方法：采用水溶性四氯唑（WST-8）法测As2O3对四种细胞株的细胞毒活性，实时定量PCR测定As2O3处理后四细胞株中AQP9 mRNA表达水平，免疫印迹法检测其中AQP9蛋白表达水平。结果 1～64μΜ As2O3能显著抑制四种细胞株的增殖，且这些变化呈明显的剂量依赖关系。其中IC50值较高的AsRE和HepG细胞存活率显著高于IC50值较低的ECV-304和L-02细胞。As2O3处理后AsRE和HepG细胞中AQP9 mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显下调，而ECV-304和L-02细胞AQP9的表达没有明显变化。结论 As2O3对不同敏感性细胞毒性有所不同，水通道蛋白AQP9的表达被As2O3所上调，其可能在砷的毒性发挥中扮演重要角色。
获奖情况
- 尚在投稿中。
鉴定结果
- 尚在投稿中。
参考文献
- 1 Miao ZF, Chang EE, Tsai FY, et al. Increased aquaglyceroporin 9 expression disrupts arsenic resistance in human lung cancer cells. Toxicol In Vitro[J] 2009,23:209-216. 2 Shinkai Y, Sumi D, Toyama T, et al. Role of aquaporin 9 in cellular accumulation of arsenic and its cytotoxicity in primary mouse hepatocytes. Toxicol Appl Pharmacol[J] 2009,237:232-236. 3 horsen M, Di Y, Tangemo C, et al. The MAPK Hog1p modulates Fps1p-dependent arsenite uptake and tolerance in yeast. Mol Biol Cell[J] 2006,17:4400-4410. 4. Abernathy CO, Liu YP, Longfellow D, et al. Arsenic: health effects, mechanisms of actions, and research issues. . Environ Health Perspect[J] 1999,107:593-597. 5 Evens AM, Tallman MS, RB G. The potential of arsenic trioxide in the treatment of malignant disease: past, present, and future. Leuk Res[J] 2004,28. 6 Verkman AS, Mitra AK. Structure and function of aquaporin water channels. Am J Physiol Renal Physiol[J] 2000,278:F13-28.
同类课题研究水平概述
- 当前对砷的毒性及耐受性机制研究主要集中在砷进入和排出细胞的方式与机制研究中。砷的毒性发挥与其在细胞中砷的蓄积呈明显的剂量关系，不同的细胞对砷的敏感性是不同的。另外砷作为一种化疗药物在临床上应用于治疗肿瘤，但肿瘤细胞对砷会产生耐受性阻碍其临床的使用。因此抗砷机制研究对于砷中毒的防治及解决临床耐药难题均有重要意义。 国内外对于砷的入胞与出胞机制有许多研究报道，目前AQP9通道蛋白作为一个负责砷进入细胞的通道被国外许多研究报道所证实，如Shinkai等采用甘露醇作为AQP9的竞争性抑制剂处理小鼠肝细胞以及通过siRNA干扰AQP9的表达，发现都会导致细胞中砷摄入浓度及其毒性的显著降低，而在HEK293细胞中过量表达AQP9则增加细胞内砷的含量。但在哺乳动物ECV-304及其经过诱导的抗砷性ECV-304细胞AQP9的表达还未见报道，用不同浓度砷处理这两种细胞，以及肝癌细胞HepG2和肝正常细胞L-02后，AQP9的表达差异也未见报道。 当前哺乳动物中砷依赖于AQP9的入胞机制受何种信号途径的调控迄今为止没有得到非常明确的解释。本研究为阐明其调控机制奠定基础。
