基本信息
- 项目名称：
- 虹彩病毒感染致养殖大鲵大规模死亡的PCR及病理形态学诊断
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 为探索陕西汉中，甘肃陇南，四川珙县、乐山等多处养殖大鲵发生腐皮病症并大规模死亡的原因，本试验采用PCR技术，建立针对大鲵虹彩病毒感染的PCR检测方法，用以确定该病的病原是虹彩病毒，为该病的预警、快速检测试剂盒及抗病血清等的制备等奠定基础；同时从病理解剖学，组织病理学及超微病理学三个层次对其进行病理形态学诊断，为该病的临床诊断及致病机理研究提供参考。
- 详细介绍：
- 大鲵(Andrias davidianus)，俗称娃娃鱼，属于两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科、大鲵属，是现存个体最大的两栖动物，为我国珍稀、濒危物种，属于国家二级保护动物，在动物进化史上有着重要的科学研究价值，已被列入CITES公约附录Ⅰ中。自20世纪50年代起，由于过度收购、非法捕杀和栖息地丧失等原因，野生大鲵分布范围和资源已急剧下降，部分种群已经灭绝，在中国濒危动物红皮书中大鲵被列为极危级。1978年，我国首次人工繁殖大鲵成功，其后我国各地陆续开展了人工养殖和繁育大鲵。由于大鲵养殖具有极高的经济价值，其养殖得以迅速发展，其养殖区域遍及我国18个省份，成为许多地区发展现代农业、特色农业、观光农业和出品创汇型农业的龙头品种。但随着养殖规模的迅速扩大，大鲵的各种病害也接踵而至，如迟缓爱德华氏菌感染、腹水症、恶臭假单胞菌感染和水霉病等，严重阻碍大鲵养殖的发展，甚至一些疾病可以在野生大鲵品种和人工繁育品种间相互感染，造成大鲵的大规模死亡，大鲵腐皮病就是其中非常典型的一例。2009年9月至今，陕西汉中，甘肃陇南，四川珙县、乐山等多处养殖的大鲵发生以皮肤上出现白点、出血斑、溃疡，四肢肿胀、溃烂和头部肿胀为特征的疾病，致死率可达90%以上，被称为大鲵的“头号杀手”。大鲵的市场价值极高，目前约2000元/kg，大鲵的大规模死亡性疾病不仅给众多养殖户带来了毁灭性的损失，更将我国的生物多样性保护置于了一个险恶的境地。为探索该病的发生原因，本试验采用PCR技术，根据Genbank上已公布的大鲵虹彩病毒MCP基因中高度保守区设计引物，特异性扩增出500bp的目的片段，建立针对大鲵虹彩病毒感染的PCR检测方法，用以确定该病的病原是虹彩病毒，为该病的预警、快速检测试剂盒及抗病血清等的制备等奠定基础；同时从病理解剖学，组织病理学及超微病理学三个层次对其进行病理形态学诊断，再次验证虹彩病毒的存在并充分掌握虹彩病毒感染大鲵的病理形态学变化特征，为该病的临床诊断及致病机理研究提供参考。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：证实造成腐皮病病鲵大规模死亡的原因是虹彩病毒感染，为该病的进一步研究奠定基础。 思路：根据Genbank上已公布的大鲵虹彩病毒基因组保守区序列设计1对特异性引物，特异性扩增出500bp的目的片段，建立针对虹彩病毒的PCR检测方法；对经PCR确诊为虹彩病毒感染的养殖大鲵自然病例进行病理形态学变化观察，充分掌握虹彩病毒感染大鲵的病理形态学变化特征并再次验证虹彩病毒的存在。
科学性、先进性及独特之处
- 1、首次通过PCR结合病理学诊断证实了虹彩病毒感染对大鲵的危害,填补了国内此项研究的空白； 2、所建立的虹彩病毒PCR诊断方法，能于疾病发生早期检测到带毒大鲵中虹彩病毒的存在，对该病发生具有预警作用； 3、所总结的大鲵虹彩病毒感染的特征性病变，为生产上该病的临床诊断提供直接依据； 4、对虹彩病毒在全球水生动物感染范围的扩大具有警示作用，呼吁人们关注该类疾病，为生物多样性保护做出贡献。
应用价值和现实意义
- 明确病原才能更好的控制和预防传染病的发生，针对引起我国大鲵腐皮病的病原—虹彩病毒，对其诊断成为关键。本试验所建立的虹彩病毒PCR诊断方法，能于疾病发生早期检测到带毒大鲵中虹彩病毒的存在，对该病发生具有预警作用，并可以广泛应用于其他水生动物虹彩病毒感染的检测；所总结的大鲵虹彩病毒感染的特征性病变，为生产上该类疾病的临床诊断提供直接依据。
学术论文摘要
- 中文摘要：对四川珙县、乐山，陕西汉中，甘肃陇南等地养殖场自然发生腐皮病并大规模死亡的大鲵进行虹彩病毒感染的诊断，针对虹彩病毒的特异性PCR扩增出虹彩病毒衣壳蛋白基因500bp的目的片段，测序后在GenBank内blast分析，发现其与虹彩病毒衣壳蛋白基因同源性达98%，确认该病是由于虹彩病毒感染所致，率先报道了虹彩病毒感染对我国养殖大鲵的危害。对PCR结果呈阳性的养殖大鲵自然感染病例进行病理形态学变化观察，结果显示病鲵所表现出的多组织器官病理损伤特点，尤其是皮肤、消化道、肾、肝与脾等的变性坏死，与国外已报导的两栖动物虹彩病毒感染病理损伤基本一致，并在病变组织见圆形或椭圆形嗜酸性胞浆包涵体；超微结构上，肝、脾、肾细胞发生明显的病变并在病变细胞内发现大量直径在180~240nm的虹彩病毒样颗粒，再次证实了虹彩病毒的存在。 关键词：大鲵；虹彩病毒；PCR；病理形态学；诊断
获奖情况
- 荣获四川农业大学第七届“挑战杯”校级二等奖； 已向《中国水产科学》投稿一篇
鉴定结果
- 内容真实，同意申报！
参考文献
- [1] Mao J, Hedrick RP, CHINCHAR VG. Molecular characterization, sequence anlysis, and taxonomic position of newly isolated fish iridoviruses[J]. Virology,1997, 229:212-220. [2] Greer AL, Michael B, Wilson PJ. Five amphibian mortality events associated with ranavirus infection in south central Ontario, Canada [J]. Dis Aquat Org, 2005, 67(9):9-14. [3] Miller DL, Gray MJ, Rajeev S,etal. Pathological findings in larval and juvenile anurans inhabiting farm ponds in tennessee,USA [J].Wildl Dis,2009, 45:314-324. [4] Gray MJ, Miller DL, Hoverman JT. Ecology and pathology of amphibian ranaviruses[J].Diseases of Aquatic. Organisms, 2009, 87, 243-266.
同类课题研究水平概述
- 大鲵作为一种我国特有珍稀、濒危两栖物种，具有很高的药用价值与营养价值，其养殖在我国已有较长的时间，但对其疾病的研究却相对滞后。目前主要集中在寄生虫病与细菌性疾病上，如嗜水气单胞菌、假单胞菌和迟缓爱德华氏菌等。虹彩病毒是一类感染低等脊椎动物和无脊椎动物的二十面体状、大型细胞质DNA病毒，是水产养殖动物重要的病毒性病原，自上世纪60年代Granoff等首次分离到虹彩病毒以来，虹彩病毒对鱼类、两栖类和爬行类的危害越来越严重，被称为冷血动物的杀手，虹彩病毒感染也受到人们的高度关注，OIE已将虹彩病毒感染列入法定报告的疾病名单。 对于两栖动物的虹彩病毒感染，国外学者在蝾螈与蛙虹彩病毒感染的病理学方面进行了较为详细的研究，这对阐明虹彩病毒感染这些动物的致病机理提供了重要资料。我国关于虹彩病毒感染两栖动物的报道较少，但是虹彩病毒危害其他水生动物的实例已是层出不穷。在我国已有虹彩病毒感染牙鲆、大菱鲆、鳜鱼、石首鱼、鳖和蛙，并引起大量死亡的报道。虹彩病毒科病毒具有独特的形态学特征，病毒呈六角形、二十面体对称，有包膜，在细胞浆内装配，具有独特的嗜酸性胞浆包涵体。该特征结合临床上头部、四肢肿胀，溃烂以及皮肤出血与溃疡形成特点可作为初步诊断大鲵虹彩病毒感染的病理学依据之一。 目前，我国关于大鲵疾病的研究多集中于细菌方面并且时有报道。本研究中发现大鲵虹彩病毒感染所表现出的症状主要为头与四肢的肿胀，坏死、溃烂，腹水，以及体表皮肤的出血、局灶性坏死与溃疡形成。回顾国内有关大鲵疾病的研究报道，曾被称为大鲵溃烂病、腹水病中都有类似的病变，然而在对这些病例病因分析中都未进行病毒性病因的检测。Debra等的研究发现在感染虹彩病毒的牛蛙与林蛙体内能分离到嗜水气单胞菌、假单胞菌和不动杆菌等条件致病菌，他们认为由于虹彩病毒感染引起免疫器官与体内多脏器官的损伤，使蛙对这些条件致病菌的易感性增加所致，因此可见，虹彩病毒对我国大鲵的危害可能在此之前就已存在。在生产实践中，由于尚没有合适的虹彩病毒检测技术，养殖业者通常只能凭经验将大鲵皮肤溃烂作为诊断该病的主要依据，本试验中所建立的较为完备的病理学观察及PCR检测方法将为今后的水生动物病毒检测提供一条可行性途径。
