基本信息
- 项目名称：
- PiggyBac转座子在细胞中的转基因研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本项目旨在改造来自于昆虫类的转座子PiggyBac，经过启动子筛选和序列修饰，以其获得一种高效转基因技术，从而为哺乳类动物转基因制备和人类基因治疗载体的研制奠定基础。
- 详细介绍：
- 本实验应用现代生物技术和分子克隆技术方法，将PiggyBac转座子元件改造成适合哺乳类动物细胞的高效转基因载体。该基因载体以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因为报告基因，以新霉素抗性（Nero）基因为哺乳动物细胞抗性筛选基因。在实验起始阶段，设计引物人工合成引物序列，利用引物经聚合酶链式反应法（PCR）扩增获得GFP基因序列。将该基因转入克隆质粒载体pIR-CMV。转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，进行扩增。然后，提取重组质粒进行PCR鉴定，获得pIR-CMV-GFP载体，与含有PiggyBac编码序列的载体pDNA-piggyBac，以脂质体转染法分别进行细胞转染试验。实验结果表明，以PiggyBac介导的绿色荧光蛋白基因在哺乳动物细胞内能够高效的表达。由此可见，经改造的PiggyBac转座子元件可以成为哺乳类动物细胞的高效转基因载体。这就为进一步进行哺乳动物细胞转基因研究奠定了基础。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 改造来自于昆虫类的转座子PiggyBac，经过启动子筛选和序列修饰，以其获得一种高效转基因技术，从而为哺乳类动物转基因制备和人类基因治疗载体的研制奠定基础。 现有资料表明，转座子具有高效的基因组间转移功能，针对来自于昆虫的PiggyBac转座子系统进行改建，从基因启动子、靶基因序列筛选以及转染方法等方面开展研究，探索新型高效的转动物技术方法。
科学性、先进性及独特之处
- 本课题采用现代先进的分子生物学技术，将PiggyBac转座子元件改造成适合哺乳类动物细胞的转基因载体，实现了转基因在哺乳动物体内的高效表达，为进一步进行哺乳动物细胞转基因研究奠定了基础。
应用价值和现实意义
- 构建成的转座子基因载体能够有效地将目标基因转入靶细胞并有效表达。 具体应用包括： 可应用于转基因小鼠模型以及人类基因治疗相关研究中； 可作为基因功能鉴定的有效工具，探寻人类功能基因的确证，发现人类疾病如肿瘤、癌症等相关重要功能基因。
学术论文摘要
- 本实验应用现代生物技术和分子克隆技术方法，将PiggyBac转座子元件改造成适合哺乳类动物细胞的高效转基因载体。该基因载体以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因为报告基因，以新霉素抗性（Nero）基因为哺乳动物细胞抗性筛选基因。在实验起始阶段，设计引物人工合成引物序列，利用引物经聚合酶链式反应法（PCR）扩增获得GFP基因序列。将该基因转入克隆质粒载体pIR-CMV。转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，进行扩增。然后，提取重组质粒进行PCR鉴定，获得pIR-CMV-GFP载体，与含有PiggyBac编码序列的载体pDNA-piggyBac，以脂质体转染法分别进行细胞转染试验。实验结果表明，以PiggyBac介导的绿色荧光蛋白基因在哺乳动物细胞内能够高效的表达。由此可见，经改造的PiggyBac转座子元件可以成为哺乳类动物细胞的高效转基因载体。这就为进一步进行哺乳动物细胞转基因研究奠定了基础。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 查鑫华等同学作品《PiggyBac转座子在细胞中的转基因研究》，实验设计合理，报告内容属实，具有较高的创新价值。
参考文献
- （1）邓海莹, 张磊等，piggyBac转座子生产转基因动物研究进展， 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十四届学术研讨会论文集，2008； （2）张博, 陈兵等， 昆虫的转座子及其功能， 昆虫知识, 2009 , 46 (2):187～195； （3）唐丽莉,陈斌等,piggyBac转座子及其转基因昆虫的应用，安徽农业科学， 2010年第06期； （4）颜海燕,钟伯雄等，昆虫转基因载体--piggyBac转座子， 蚕业科学， 2000年 第Z1期 （5）Collier,L，S．，Carlson，C．M．，Rwimohm，S．，Dupuy,AJ．，and Larguespada,D．A．(2005)．Cancer gene discovery in solid tumonrs using transposon-based somatic mutagencsis in the mouse．Nature 436,272-276； （6）Davie，S．A．，Maglione，J．E．，Manner,C．k，Young,D，，Cardiif,ILD．，Macleod,C⋯L end Ellies，L．G (2007)．Effects of FvB，NJ and C57BI／6J strain backgrounds on mammary mmor phenotype in inducible nitric oxide synthase deficient mice．Transgenic Res 16,193-201．
同类课题研究水平概述
- 目前现有的转基因动物技术主要应用经典的原核显微注射法和核移植法，该技术存在缺陷是转基因元件在动物基因组整合率很低，整个实验操作复杂，所需成本很高。随后开发的病毒介导的转基因技术，可以获得高效率的转基因，但是问题是病毒对宿主细胞造成潜在的危险，即便是复制缺陷型的重组病毒，同样存在病毒的生物安全性问题，因此，急需探索新的用于动物转基因技术制备的元件。 转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置（Barbara Mclintock）。这一元件不仅可用于分析生物遗传进化上分子作用引起的一些现象，而且为基因工程和分子生物学研究提供了强有力的工具。在昆虫、家蚕以及模式生物果蝇中，研究者已经成功应用转座子元件，如P因子，获得了转基因果蝇新品系，但是多数类似的转座子元件不能独立应用于哺乳类动物，直到最近几年，国际上研究者逐渐开发出了几种，其中Sleeping Beauty（SB）研究最多，但是SB载体系统存在诸如转座效率低和携带目标基因容量小等很多问题，限制了其进一步的应用。 因此，本项目旨在改造来自于昆虫类的转座子PiggyBac，经过启动子筛选和序列修饰，以其获得一种高效转基因技术，从而为哺乳类动物转基因制备和人类基因治疗载体的研制奠定基础。
