基本信息
- 项目名称：
- 腈水解酶序列结构功能分析与酶的应用
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 本作品对腈水解酶基因进行筛选，克隆/合成了一系列腈水解酶，并使它们在大肠杆菌中进行表达，得到了一定活力的腈水解酶。为提高腈水解酶的活力和稳定性，本研究采用同源建模、分子对接手段建立判断腈水解酶类型的方法，在基因水平上对腈水解酶进行改造，最终分别得到了应用于制备R-扁桃酸（医药中间体）及亚氨基二乙酸（农药中间体）的2个腈水解酶，为工业化生产奠定了基础。
- 详细介绍：
- 本研究对腈水解酶基因进行筛选，克隆/合成了一系列腈水解酶基因，并使它们在大肠杆菌中进行表达，得到了一定活力的腈水解酶。为提高腈水解酶的活力，采用同源建模、分子对接手段建立判断腈水解酶类型的方法，在基因水平上对腈水解酶进行改造，最终分别得到了应用于制备R-扁桃酸（医药中间体）及亚氨基二乙酸（农药中间体）的2个腈水解酶，为工业化生产奠定了基础。 立体选择性腈水解酶生物催化合成医药中间体—R-扁桃酸的研究：设计特异引物，以粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis ZJUTB10)基因组DNA为模板进行PCR扩增，克隆测序分析得知该腈水解酶基因读码框全长1068 bp, 与来自Pseudomonas putida strain MTCC 5110 的腈水解酶cDNA结构基因同源性为78 %，进一步分析了氨基酸序列的保守位点并模拟了蛋白质的三维空间结构。构建得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-NIT，经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳检测出有明显的目的蛋白（约40 KDa）表达。对该腈水解酶酶学性质进行了研究，其最适反应温度为40℃，最适pH为7-8，Ca2+、Mg2+对酶促反应有促进作用，而Ag+和Hg2+对酶有强烈的抑制作用。最终，在20 mM底物浓度下，该腈水解酶对扁桃腈转化率>90%，R-扁桃酸e.e.>99%，对底物扁桃腈，该酶的Km值为4.74 mM，Vmax值为 15.85 μmol min–1 mg–1 protein。 腈水解酶生物催化制备农药中间体—亚氨基二乙酸的研究：利用PCR assembly合成了不同来源的9条腈水解酶序列，采用同源建模、分子对接手段建立判断腈水解酶类型的方法。通过对不同类型的腈水解酶进行结构分析，选择了合适的突变位点，在基因水平上对其中的一个腈水解酶进行分子改造，最终，在1 %底物（亚氨基二乙腈）浓度下，该亚氨基二乙腈水解酶对亚氨基二乙腈转化率由最初的60 %提高到95 %。 综上，这两个腈水解酶作为具有自主知识产权的优秀生物催化剂，将在精细化学品生产中有重要的理论研究意义和广阔的应用前景。
作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 创新点： ①开展了腈水解酶结构与功能之间的研究，建立一种基于计算机分析的快速判断腈水解酶类型的方法（国内外论文对腈水解酶的研究大多是从它的应用角度展开的）； ②通过计算机模拟分析各个种类的腈水解酶结构特点，结合氨基酸的二级结构比对、蛋白质的三级结构比对结果，选择空间上相对集中且适当远离活性位点的氨基酸残基作为突变位点进行突变，大幅提高了酶的活力（此项针对腈水解酶的研究国内外尚无报道）； ③利用生物法生产制备除草剂草甘膦的关键中间体亚氨基二乙酸（国内外尚无报道）。 技术关键： ①设计同源引物，克隆得到腈水解酶基因是项目进行的关键； ②在腈水解酶C端或N端设计亲和标签是利用Ni-NTA亲和柱分离纯化重组腈水解酶，获得电泳纯重组酶的关键； ③利用生物信息学，分子动力学及计算机分子对接技术预测和模拟底物与腈水解酶结合方式和酶催化机理是建立一种判断腈水解酶类型方法的关键； ④对腈水解酶的结构分析、选择有效的突变位点，是腈水解酶分子改造成功的关键。 主要技术指标： ①成功建立分析腈水解酶结构与功能关系的模型； ②构建得到若干株基因工程菌，能应用于医药中间体的制备与农药中间体的生产； ③建立腈水解酶基因的快速筛选模型； ④分子改造后的突变菌株基本能实现工业化。
科学性、先进性
- 本作品利用分子生物学技术最终得到了2株含腈水解酶基因工程菌，其中一株菌产腈水解酶催化反应，产物R-扁桃酸的得率大于98%，e.e.值超过99%，达到国际先进水平；另一株菌能利用腈水解酶生产制备草甘膦的关键中间体亚氨基二乙酸，新开发的路线能耗低、环境友好，国内外首次报道。 本研究通过计算机模拟分析各个种类的腈水解酶结构特点，结合氨基酸的二级结构比对、蛋白质的三级结构比对结果，选择空间上相对集中且适当远离活性位点的氨基酸残基作为突变位点进行突变，提高了酶的活力。 本项目开展了腈水解酶结构与功能之间的研究，建立了一种基于计算机分析的快速判断腈水解酶类型的方法，而国内外论文对腈水解酶的研究大多是从它的应用角度展开的。
获奖情况及鉴定结果
- A novel synthesis of iminodiacetic acid: Biocatalysis by whole Alcaligenes faecalis ZJB-09133 cells from iminodiacetonitrile,Biotechnology Progress,2011 Gene cloning,expression and characterization of a nitrilase from soil bacterium Alcaligenes faecails ZJUTB10,in press Characterization of an enantioselective amidase from Delftia tsuruhatensis CCTCC M 205114 and its application in asymmetric hydrolysis of (R)-2,2-dimethylcyclopropane carboxamide,Journal of Biotechnology,in press 改进酶稳定性的定向进化技术,生物技术通报,2010(R)-邻氯扁桃酸的制备技术进展,化工进展,2011氯吡格雷生产技术的研究进展,现代化工,出版中 诱变选育产腈水解酶高产菌株,食品与发酵工业,出版中 生物催化邻氯扁桃腈不对称合成(R)-邻氯扁桃酸,第六届全国化学工程与生物化工年会.2010.长沙 粪产碱杆菌腈水解酶基因的克隆、表达及酶学性质的研究,第三届长三角生物技术研究生学术论坛.2010.上海.优秀论文奖 催化水解亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸菌株的诱变育种.第三届长三角生物技术研究生学术论坛.2010.上海 浙江工业大学“运河杯”特等奖
作品所处阶段
- 生产阶段
技术转让方式
- 专利
作品可展示的形式
- 现场演示
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 一、建立了高效R-扁桃酸生物合成工艺，实现工业生物技术提升传统化学工业，技术成果转让主要面向制药和化工企业；目标产物R-扁桃酸e.e.值超过99%，满足市场对高纯度R-扁桃酸的生产需求；并建立了绿色转化过程和提取过程。 推广前景：有效地提升我国的生物医药产业，组成有重要经济价值的产业链。有利于我国生物技术产业的进一步提升，并可创造可观的经济效益。本研究对发展我国的生物医药行业有重要的作用，因此，本项目具有非常好的经济、社会效益，已在浙江来益生物有限公司建成年产100吨的生产线。 二、亚氨基二乙酸作为一种合成除草剂草甘膦的重要农药中间体。预计到2015年，草甘膦全球的需求量将超过100万吨。目前，草甘膦占全球除草剂总量的1/3，市场销售额约为150亿美元。目前的化学法合成成本高、污染严重。 推广前景：目前我们正在进行中试实验，实验反应条件温和，副反应少，收率高，无环境污染，已为日后的大规模工业生产奠定了基础，则需要进行更加深入的研究。
同类课题研究水平概述
- 腈水解酶能够催化腈水解生成相应的羧酸和氨。根据腈水解酶的底物特异性，可分三种：芳香族、脂肪族和芳基乙腈类腈水解酶。 目前，大部分腈水解酶已被详细表征，相当部分腈水解酶亚基的分子量及天然结构已经被确定。对比研究发现，不同来源的腈水解酶的亚基分子量和天然构象不尽相同，许多腈水解酶包含相同的多肽，分子量为40kDa左右；不同酶含有的亚基数量也不同，一般亚基数为2-26。最近，Brenner等人根据蛋白质结构及酶学数据，核对了176个酶的序列，将整个腈水解酶家族进行了重新定义。根据蠕虫的NitFhit晶体结构分析，腈水解酶活性部位含有Glu-Lys-Cys三个残基，其中半胱氨酸上的残基在催化反应中的作用十分关键。腈水解酶在有机合成重要中间体——有机羧酸的制备中有十分重要的应用。现有研究表明：腈水解酶生物催化法制备有机酸具有高效性、高选择性、反应条件温和等优点，有着化学方法无可比拟的优越性。 利用腈水解酶作为生物催化剂制备有机羧酸已被广泛开发和应用。瑞士Lonza公司已采用腈水解酶催化方法工业生产B族维生素烟酸和烟酰胺。日本日东公司利用生产丙烯酰胺的第三代菌种R. rhodochrous J1的固定化细胞进行催化生产，通过改变培养条件分别诱导腈水解酶和腈水合酶可以得到单一产物，通过将产物不断分离的方法可以减轻产物对酶的抑制，从而提高生产效率。另外，腈水解酶具有良好的立体选择性，可以催化合成各种光学纯的羧酸。其中，最成功的例子是德国BASF公司利用粪产碱菌A. faecalis ATCC 8750腈水解酶不对称合成(R)-(-)-扁桃酸，它是半合成头孢菌素和青霉素的中间体，手性拆分试剂，抗肿瘤药物和抗肥胖药的重要手性合成子。未反应的S-扁桃腈由于化学平衡而参与外消旋化，该反应的收率达91%，产物的光学纯度为100%。目前该项目已经以年产几吨的规模开始试生产。Lonza公司还筛选了新的腈水解酶菌种，用于5-羟基吡嗪-2-甲酸及5-羟基吡啶-2-甲酸的生产。还有报道利用菌株腈水解酶和烟酸胺脱氢酶的共同作用，分别从2-氰基吡嗪和2-氰基吡啶出发，合成药物中间体5-羟基吡嗪-2-甲酸及5-羟基吡啶-2-甲酸，转化率接近100%。
