基本信息
- 项目名称：
- PCR-SSP法检测29种HLA-B27亚型
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本次检测强制性脊柱炎(ＡＳ)方法是在新的高分辨ＰＣＲ－ＳＳＰ法基础上建立起来的。与以往检测相比，此法充分考虑所设计引物的特异性，实验结果表明，此法能够检测出以往方法不能达到的２９条基因亚型。该法根据内对照及有无特异性区带使判定结果一目了然，可以快速准确的对ＨＬＡ－Ｂ２７的相关亚型进行检测，从亚型水平探究AS的发病机制，提供了临床上早期诊断AS的新方法。
- 详细介绍：
- 本次检测强制性脊柱炎(ＡＳ)方法是在新的高分辨ＰＣＲ－ＳＳＰ法基础上建立起来的。与以往只能检测７～２３条亚型的不足而造成的缺乏性和完整性不足相比，此法充分考虑所设计引物的特异性，并对多数已有的ＰＣＲ检测条件做出相应调整，实验结果表明，此法能够检测出以往方法不能达到的２９条基因亚型。该法根据内对照及有无特异性区带使判定结果一目了然，可以快速准确的对ＨＬＡ－Ｂ２７的相关亚型进行检测，从亚型水平探究AS的发病机制，提供了临床上早期诊断AS的新方法，为进一步研究ＨＬＡ－Ｂ２７与疾病的关联，深入探讨ＡＳ的发病机制奠定了基础。同时与传统医学检测手段相比，本检测手段可以较全面检测尽可能多分子亚型，对器材要求低，速度快，在基因水平诊断上,具有良好的预见性,非常适于临床应用。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的:建立一种新的聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）高分辨技术检测HLA-B27基因亚型，为HLA-B27基因多态性研究奠定实验学基础。 基本思路: 设计合成HLA-B27亚型特异性引物35条（配对组成上下游引物组合29对）和内对照引物一对，建立PCR-SSP方法，用于B27亚型分型。检测标本HLA-B27阳性研究对象外周血基因组DNA。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：由于HLA-B27基因在不同人群分布有明显的差异且不同的抗原也存在差别，从分子水平研究HLA-B27亚型与AS的相关性更准确。 先进性：该法具有高度特异性、敏感性、实验操作简便快速、对样本要求低和无需昂贵设备等特点，内对照的引入更保证了检测结果的可靠性。 独特性：高分辨HLA-B27亚型检测可分析多达29种亚型；根据内对照及有无特异性区带使判定结果一目了然、快速准确。
应用价值和现实意义
- PCR-SSP法从基因的多态性出发，可以检测HLA-B27的32种亚基中的29种，范围更广，满足当前医学检测需要。与血清法、流式细胞术等相比具有准确性高、灵敏度强、耗材少、用时少、成本低等优越性，更适用于医学类尤其是医院检测。且在临床上对于AS的早期诊断和治疗具有重要意义，适于患者早期确诊，区分类风湿类疾病与AS患者，避免误诊。本实验进一步证明AS与HLA-B27的相关性，具有医学意义。
学术论文摘要
- 目的 建立一种新的聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）高分辨技术检测29种HLA-B27基因亚型。方法 设计合成HLA-B27亚型特异性引物35条（配对组成上下游引物组合29对）和内对照引物一对，建立PCR-SSP方法，用于B27亚型分型。检测标本为117例HLA-B27阳性研究对象（男79名，女38名）外周血基因组DNA 。 结果 117例标本的PCR-SSP扩增均获得成功，成功的构建了PCR-SSP检测反应体系。共检测出6种亚型：B*2702、B*2703、B*2704、B*2705、B*2706及B*2713。六种亚型的构成比分别为：0.85%、6.84%、64.10%、25.64%、1.71%、0.85%，其中B*2704和B*2705为中国汉族人群中主要亚型。 结论 应用该新型PCR-SSP高分辨技术进行HLA-B27基因亚型检测能检测出较多HLA-B27亚型，且该法进行B27亚型分型分辨度高、特异性强，成本较低，适合于临床应用。
获奖情况
- 于《分子诊断与治疗杂志》（ISSN 1674-6929；CN 44-1656/R）2011年5月第3期刊发
鉴定结果
- 117例标本扩增均获得成功，构建了PCR-SSP检测反应体系。 共检测出6种亚型：B*2702、B*2703、B*2704、B*2705、B*2706及B*2713。
参考文献
- [1]Schlosstein L, Terasaki PI, Bluestones R, et al. High association of an HL-A antigen, B27, with ankylosing spondylitis. N Engi J Med, 1973, 288:704-706. [2]Brewerton DA, Caffrey M, Hart FD, et al. Ankylosing spondylitis and HLA-B27. Lancet, 1973, 1 (7809): 904-907. [3]Taurog JD. The Mystery of HLA–B27: If It Isn’t One Thing, It’s Another. Arthritis Rheum, 2007, 56: 2478-2481. [4] Dowing J, Coates E, Street J, et al. A High-Resolution Polymerase Chain Reaction-Sequence-Specific Primer HLA-B*27 Typing Set and Its Application in Routine HLA-B27 Testing. Genet Test, 2006, 10:98–103. [5]Downing J, Guttridge MG, Thompson J, et al. Five-locus HLA typing of haematopoietic stem cell donor volunteers by PCR using sequence specific primers. Genet Test , 2004, 8:301–312. [6] 李一荣，胡丽华，陈凤花，等. 应用SYBR GreenⅠ实时荧光PCR法对中国汉族人群HLA-B27进行快速基因分型. 临床血液学杂志，2008，21（5）：526-529. [7] 冯忠军，贺端明. HLA-B27的检测及其临床应用. 河北医，2008.1，30（1）：90-92. [8] 张相文，兰炯采，郑世荣. HLA-B27PCR基因分型及血清学结果比较. 中国输血杂志，1997,10：671.
同类课题研究水平概述
- 目前检测HLA-B27基因亚型手段中，常用的有经典的血清学分型技术、流式细胞术及磁珠酶联免疫检验法和基因分型技术，不常用的有玫瑰花法、ELISA法等。 1,微量淋巴细胞毒法 HLA- B27抗原与其特异性抗体结合.优点: 操作简便，准确率尚可且,成本较低;缺点:单价血清获取困难，受细胞纯度、补体差异、操作繁琐，单抗效价及HLA高度多态性的影响，易出现错判漏判. 2, 流式细胞技术 流式细胞技术结合单克隆抗体，可以迅速区分出淋巴细胞亚群，并检测出CD+3细胞中HLA-B27抗原阳性的细胞百分比.优点: 可以迅速区分出淋巴细胞亚群,结果精确;缺点:HLA-B27单克隆抗体和仪器只有较大医院才拥有。 3, 磁珠酶联免疫检验法 结合磁珠分离和酶联免疫分析,分离全血中HLA-B27抗原及白细胞及染色。优点:特异性强,敏感度高,重复性好。缺点:操作步骤复杂。 4, HLA基因分型技术 目前检测HLA-B27亚型的基因分型技术主要有聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP），DNA 限制性片段长度多态性分析, PCR-单链构象多态性及PCR-DNA测序等方法。最为常用的为PCR-SSP，其优点为: 准确性高、灵敏度强、耗材少、用时少、成本低等优越性，更加适用于医学类尤其是医院检测. 缺点:易受感染出现假阴性和标本的DNA交叉污染. 文献资料显示，绝大多数实验室采用检测HLA-B27方法为微量淋巴细胞毒试验检测法. HLA基因分型技术较血清学分型有以下优点：(1)只需全血0.5 ml即可获得足够数量的DNA，并可重复数十次试验；(2)可保存于无水乙醇中，视其纯度存放多年；(3)由于加入了429 bpHGH内对照引物，使实验方法更加可靠，避免出现漏检和假阳性反应；(4)实验快捷简便，特异性强、灵敏度高、稳定性好。微量的DNA就可以扩增达到106～107倍的量，达到常规方法检测所需的浓度. 由于受HLA基因分型技术的限制，以往的研究中往往只能分析少量HLA-B27亚型，从亚型水平探讨AS的发病机制的研究结果缺乏精确性与完整性。因此创建的一种新的PCR-SSP高分辨技术，以检测到更多种HLA-B27基因亚型，为进一步研究HLA-B27基因亚型与AS的关系打下实验室基础，这是国内外许多学者研究的热点之一。
