基本信息
- 项目名称：
- 琼胶酶海洋菌发酵条件优化、酶促动力学及降解产物开发研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 我们利用海洋的优势，将筛选获得的琼胶酶生产菌与实验室菌株进行比较研究后，最后选择高活性产酶菌株白色噬琼胶菌NBRC102603作为研究对象。主要进行的工作包括产酶条件的优化，酶的分离纯化，酶促动力学研究，酶的固定化以及固定化酶解产物琼寡糖的分离纯化及其抗氧化性研究。通过这一系统研究，为琼胶酶的生产应用提供了一定的理论基础，也为开发琼胶保健食品, 拓宽琼胶酶的应用提供了实验依据。
- 详细介绍：
- 海洋作为生命之源，孕育着无限丰富的生物资源，海洋药物研究以及功能性食品的开发越来越受到人们的重视。琼脂是目前世界上应用最广泛的的海藻胶之一。天然琼脂主要存在于某些海藻的细胞壁中，琼胶酶在海藻的单细胞分离、酶解破壁制备原生质体等过程具有重要的使用价值，是一种海藻遗传工程的工具酶。同时，琼胶酶在分子生物学方面、海藻多糖的结构研究、制备琼脂低聚糖等方面有巨大应用价值。由于琼脂低聚糖具有多种特殊功能，例如作为天然的防腐剂、淀粉老化抑制剂、功能性食品基料、抗氧化剂、在药物方面抑制癌细胞的发生等等，而备受关注。琼胶酶降解过程不需要加入大量反应试剂，且具有得率高、污染小和产物的安全性高等优点，是降解琼脂糖最有潜力的方法。 本文首先对琼胶酶菌株NBRC102603，发酵产酶条件进行优化，提高了产酶能力。进一步对该菌株的发酵液进行了酶的分离纯化，制得了两种高活性的琼胶酶，进行了酶的性质分析，为高活性琼胶酶的生产和应用提供了一定理论基础和实验依据。 其次，琼胶酶的固定化研究在国内外尚未有相关报道，我们在使用壳聚糖和海藻酸钠进行比较研究后，确定使用壳聚糖对琼胶酶进行固定化，正交试验法选出最佳固定化工艺。同时探讨了其最适反应温度、pH值等，使固定化酶具有一定的工业生产价值。 最后，我们将固定化酶进行实际应用制备琼脂低聚糖，体外测定其抗氧化性后，用酒精作为诱导剂,建立小鼠急性肝氧化损伤模型,进一步在体内观察琼寡糖的抗氧化作用。为开发琼胶保健食品, 拓宽琼胶的应用范围进一步提供了理论依据。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 首先，对菌株发酵条件优化，提高其产酶能力。酶分离纯化后，得两种高活性酶，为琼胶酶的生产应用提供了一定的理论基础。 其次，琼胶酶的固定化研究在国内外尚未有相关报道，酶固定化后，研究其酶学性质，使固定化酶具有一定的工业生产价值。 最后，固定化酶制备琼寡糖，体外测定抗氧化性后，建立小鼠肝氧化损伤模型,进一步观察琼寡糖的抗氧化作用。为开发琼胶保健食品, 拓宽琼胶酶的应用提供了理论依据。
科学性、先进性及独特之处
- 1、从海洋菌中提取琼胶酶并将其转化到实际应用，该法环保、经济、具有可持续开发等优点，符合山东省蓝色海洋经济发展计划，体现沿海特色和较高的创新性。 2、近年来有关琼胶酶的研究较广泛，但较局限于菌株选育、产酶条件优化，酶的固定化在国内外尚未见报道。通过该研究，为琼胶酶的工业化生产提供了新思路。 3、海洋是生命之源，孕育着丰富的资源，我们利用海洋的优势，将获得的菌种进行琼胶酶提取和活性研究。
应用价值和现实意义
- 菌株发酵条件优化后，酶活力显著提高，为酶的产业化生产奠定了理论基础。 固定化酶的热稳定性，耐碱性，操作稳定性均提高，为酶的实际应用提供了理论基础。 物质Ⅱ对•OH以及DPPH具有较好的清除能力，同时能够提高GSH-Px、SOD活性, 增加GSH含量,降低MDA含量。拓宽了琼胶酶的应用范围。 我们通过对琼胶酶的基础性研究，大力开发琼脂降解产物，力求使其成为一个新的产业。
学术论文摘要
- 本文对菌株NBRC102603发酵条件优化，最佳发酵条件为：蛋白胨浓度5.0g/L、酵母膏浓度1.25g/L、琼胶浓度4.0g/L、装瓶量100ml，28℃条件下发酵48 h后酶活力最高，为58.94U/mL，比未优化前提高了2.08倍。纯化得2种酶，琼胶酶A纯化倍数为17.29倍,酶比活力为870.51U/mg; 琼胶酶B纯化倍数为16.65倍,酶比活力为838.39 U/mg。经SDS-PAGE检测,两者均显示单一条带,其相对大小分别为83.6KDa、36.8KDa。 壳聚糖对琼胶酶进行固定化，对固定化酶进行研究，结果表明:在戊二醛浓度2.5%，交联时间4h，固定3h，固定化效果最好；与游离酶相比较，固定化酶的最适反应温度及最适pH值均升高，同时固定化酶热稳定性、耐碱性、操作稳定性均提高。 利用固定化酶制备琼寡糖，对降解产物进行抗氧化活性研究。5种酶解产物中，物质Ⅱ对•OH以及DPPH具有较好的清除能力。同时观察其对酒精诱导小鼠氧化损伤的保护作用，结果表明：琼寡糖能够提高GSH-Px、SOD活性, 增加GSH含量,降低MDA含量。说明琼寡糖具有抗氧化活性。
获奖情况
- 1.作品《产琼胶酶菌株NBRC102603发酵条件优化及酶的分离纯化》，发表于食品与发酵工业（全国中文核心期刊）第四期 2.作品《琼胶酶酶学性质及固定化方法研究》，发表于基因组与应用生物学（全国中文核心期刊）第六期 3.作品《固定化琼胶酶降解产物抗氧化活性研究》，中国食品学报（全国中文核心期刊）专家外审中
鉴定结果
- 上述情况属实。
参考文献
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同类课题研究水平概述
- 琼胶酶是一种海藻工具酶,其琼胶水解产物琼胶寡糖具有多种生理活性,在医药上具有重要的应用潜力;同时,琼胶酶在海水养殖和现代分子生物学研究中也有重要的应用价值。国外对于琼胶酶的研究近几十年来多有报道,分离出一些琼胶酶高产菌株。1902年Groleau第1次从海水中分离到能分解琼胶的细菌－琼胶假单胞菌。从那以后人们从海水系统已经分离得到的琼胶分解菌包括Pseudomonas(假单胞菌属)、Pseudoalteromonsa(假别单胞菌属)、Alteromonas(别单胞菌属)、Microscilla、Vibrio(弧菌属)、Cytophaga(噬细胞菌属)等。除微生物，琼胶酶还可以从一些以海藻为食的海洋动物的肠道中分离得到，研究者采用(NH4)2S04分段盐析和葡聚糖柱层析存化技术，从九孔鲍内脏器官中提取存化了琼胶酶。除此以外，一些非海洋产生琼胶酶的菌株被发现，包括从淡水中分离到的Cytophaga sp.(噬细胞菌)，从土壤中分离到的Bacillus sp.(枯草杆菌)、Cytophaga sp.(噬细胞菌)以及Strepto-myces coelicolor(链霉菌)。 迄今为止，虽已有十几种琼胶酶得到了分离纯化，但实现了产业化生产的却只有从 Pseudomonaatlantica中分离的β-琼胶酶,并且价格昂贵，应用范围也仅限于科研工作中，大大阻碍了琼胶酶及琼胶低聚糖的开发应用。所以我们今后的工作重点应是加强琼胶酶的基础性研究，拓宽琼胶酶的来源，大力开发琼胶酶酶解产物中具有活性功能的物质，力求形成一个新的产业，一个新的经济增长点。
