基本信息
- 项目名称：
- 天山冻土产低温酶菌种分离及其系统发育研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本论文通过天对山冻土可培养细菌的分离和产低温酶菌株的筛选，了解天山冻土微生物的物种多样性和产酶菌株系统发育多样性，为高效低温酶生物技术奠定基础。实验采用稀浓度的R2A、TSB平板涂布分离天山冻土中可培养细菌；通过选择性培养基筛选产低温酶的菌株；通过16S rRNA基因序列分析确定产酶菌种的系统进化地位；通过BOX-PCR指纹技术对16S rRNA基因高度同源性的菌株进一步区分。
- 详细介绍：
- 常温环境中微生物所分泌酶类的最适反应温度一般在40-60℃，在低温条件下其催化效率大为降低。而来源于低温微生物的低温酶类最适反应温度一般在25-45℃。低温条件下具有高催化效率和高柔韧性分子构象，是低温酶中普遍存在的酶学特性。与同类型中温、高温酶相比，低温酶在低温条件下具有更低的而值和更高的转换系数Kcat或催化效率Kcat/Km，这表示酶在低温下对底物具有更强的亲和力。 目前，科学界对低温酶的研究主要集中在酶的冷适应性机制、酶的结构与功能以及其在生物工程的应用等方面，并且已从低温菌中分离纯化了低温酶，但对产低温酶菌株开展的基础性研究却很少。因此筛选出优质高效的产酶菌种是低温酶的工业化生产的首要条件。优良的菌种不仅能够提高产酶量、提高发酵底物的利用率，还能够缩短发酵周期、降低成本、改良发酵工艺，优化出最适合的发酵条件，为今后的工业生产提供一系列参数。 低温酶一般是由低温微生物产生的，因而对于产低温酶菌株的筛选是解决低温酶来源的首要且基础的问题。冻土被称为低温微生物的资源宝库，因此从天山冻土中分离、纯化低温微生物对于筛选出优质、高效的产酶菌株意义重大。 低温酶体现出来的对底物强亲和力、低温下高催化效率、高酶活性、维持正常的生理机构和功能都与酶分子本身的氨基酸组成和一级结构有关。通过对低温酶一级序列和高级结构的研究显示，与同类型的中、高温酶相比，低温酶的共同特征是：甘氨酸、天冬氨酸残基数量增加，而脯氨酸、精氨酸残基数量减少；盐桥、芳香环相互作用、疏水作用减弱；分子间、亚基间以及结构域间的相互作用减弱；使得酶与溶剂分子间的相互作用增强这些结构上的差异都赋予了低温酶蛋白分子较高的柔韧性和较低的热稳定性，也是低温酶能够适应低温的分子基础，从而能够更加适应低温环境。 有关资料表明，低温酶低温下高酶活性几乎总是与其热不稳定性相关酶的柔韧性是指蛋白质分子不同构象之间的转化，柔韧性使得蛋白分子构象异构体数目增加，酶蛋白分子在低温下可以通过改变构象，降低酶与底物结合的诱导契合过程中能量的消耗；酶的热稳定性是指酶在不同温度下保持活力的能力，研究表明，中、高温酶在室温下催化效率低是因为此时酶的紧密构象阻碍了酶分子与底物之间的相互作用，而低温酶的柔韧性能保证酶与底物的有效结合，但正是因为分子松散柔韧的结构导致了低温酶的热不稳定性。 同中温酶相比，低温酶具有下面4个特征：(1)在较低的温度下可以得到较多的酶。研究发现，低温菌酶的产量常常在低于该菌最适生长温度时最高。(2)低温酶的最适作用温度较常温酶低。(3)低温酶的比活力高，热稳定性差。(4)低温酶的活化能低，使酶在低温环境下更容易发挥催化作用，从而提高对底物的利用效率。 由于低温酶的低温催化能力，低热稳定性使其在工业应用上有以下优势：通过温和处理使低温酶失活，快速而经济地终止反应；生产过程在低温或室温下进行，无需加热和冷却，可以降低成本；生产过程便于监控。 本研究依托新疆独特的地缘环境优势，从天山一号冰川冰层含冰冻土中分离、纯化出产低温酶（低温淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶和β-半乳糖苷酶）的菌株，以解决低温酶的来源问题。通过对筛选出的菌株所产低温酶的酶学性质及低温菌株实验室最佳发酵条件的研究，进一步了解低温酶的性质，为低温酶的基础研究和工业化应用奠定一定的理论和实践基础。
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撰写目的和基本思路
- 本研究通过天山冻土细菌的分离和产低温脂肪酶菌株的筛选，了解天山冻土微生物的物种多样性和产脂肪酶菌株的系统发育多样性，为高效低温脂肪酶生物技术奠定基础。依托新疆独特的地缘环境，从天山一号冰川冰层含冰冻土中分离、纯化出产低温淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶和β-半乳糖苷酶的菌株，并在此基础上研究菌株所产低温酶的酶学性质及菌株的实验室发酵最优条件，因而具有较高的理论研究价值和实际应用意义。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：采用寡营养培养基更适合冻土微生物的培养；采用多种方案筛选产酶菌株，产酶现象明显；所得产酶菌株具有低温、高效的特点 先进性：新疆天山冻土是天然的菌种保藏库，低温微生物资源丰富；所得产低温酶微生物，多样性丰富；后续可将低温酶功能基因导入宿主细胞构建工程菌应用于工业化生产中。 独特性：实验方便可行，解决了酶的来源问题；天山冻土的特殊环境使筛选得到的产酶菌株具有低温、高效、耐盐、耐压等特点。
应用价值和现实意义
- 低温酶与中高温酶相比，经过温和的热处理即可选择性失活，可以大大缩短处理时间并省却昂贵的加热冷却系统，其较低的活化能和反应最适温度，也可节约能源、保护环境。在食品工业中，低温β-半乳糖酶可用于生产低乳糖或者无乳糖乳制品；低温蛋白酶可用于发酵食品的生产、奶酪的催熟，肉类加工中使用低温蛋白酶可起到保鲜、使肉鲜嫩的作用；低温淀粉酶在焙烤工业中可以缩短生面团发酵时间，提高面团和面包的质量。
学术论文摘要
- 摘要：【目的】通过天山冻土细菌的分离和产低温脂肪酶菌株的筛选，了解天山冻土微生物的物种多样性和产脂肪酶菌株的系统发育多样性，为高效低温脂肪酶生物技术奠定基础。【方法】采用稀浓度的R2A、TSB平板涂布分离天山冻土中可培养细菌，通过选择性培养基筛选产低温脂肪酶的菌株。采用细菌常规生理生化实验、最适生长温度、耐盐性、产酶性能对分离菌株的生理学进行研究，通过16S rRNA基因序列分析确定产脂肪酶菌种的系统进化地位，通过BOX-PCR指纹技术对16S rRNA基因高度同源性的菌株进一步区分。【结果】分离筛选到121株可培养低温菌，选择培养基显示有17株可产低温脂肪酶，3株低温淀粉酶菌株，75株蛋白酶菌株，13株β-半乳糖苷酶菌株。产酶菌分别隶属于5个系统发育类群、6个属，其中假单胞菌属(Pseudomonas)占大多数(58.9%)。【结论】天山冻土中产低温脂肪酶的细菌具有较丰富的系统发育多样性，依据生长温度，均属于耐冷菌。
获奖情况
- 1.徐宇丽, 王大伟, 刘 娅, 倪永清.天山冻土产低温脂肪酶菌株的筛选及其多样性研究.微生物学报 2011,2(51):233-240. 2.Yongqing Ni, Xuewei shi，Yuli Xu, Yan Ma, Ming Zhang and Guodong Cheng. Diversity and cold-active hydrolytic enzymes of culturable bacteria isolated from a permafrost soil in the Tianshan Mountains. Extremophiles. （Under review） 3.刘韬，马燕，倪永清.分子生物学技术在食品工业中的最新研究进展.农产品加工2010,208:(5).
鉴定结果
- 暂无
参考文献
- FEBS Letters; Annual Reviews Microbiology; European Journal of Biochemistry; Applied and Environmental Microbiology; 微生物学报; Biochemical engineering journal; Extremophiles; Bioresource Technology; Biotechnolgy and Applied Biochemistry; Journal of Agricultural and Food Chemistry.
同类课题研究水平概述
- 20世纪70年代开始，世界各国科学家的开始广泛关注低温微生物与其相关产物(如抗冻蛋白、低温酶类、多聚不饱和脂肪酸(PUFA , polyunsaturated fatty acids)、色素、抗生素、抗肿瘤药物以及质粒等)以及它们在生物工程中的潜在价值。主要研究涉及低温微生物的冷适应机制、生命的起源与进化、新菌种的鉴定与菌种系统发育分析、物质的生物地球化学循环与能量传递以及新型生物活性物质的研究开发等方面。目前在低温微生物研究领域，欧美及日本等一些传统生物技术大国，已开展了多年的研究，在国际上处于领先地位：美国对来自极地及海洋的嗜冷微生物在低温生存机制、生物工程潜在应用以及与天体生物学(Astrobiology)的联系等方面开展了探索研究，并且首次完成了对1株北极耐冷细菌(Colwellia psychrerythraea 34H)的全基因组测序工作；加拿大科研人员对北极环境污染物(如链烷、甲苯、蔡、多氯联苯等)降解细菌进行了大量研究；澳大利亚利用其毗邻南极大陆的地理优势，先后对包括嗜冷菌、耐冷菌在内的南极及南大洋微生物资源进行了大规模的调查研究与收集保藏，不仅在低温微生物的多样性和适冷机制、生物环境修复等方面开展了许多工作，还在新型药物筛选、低温酶类及多聚不饱和脂肪酸的研究与开发应用方面进行了摸索；欧盟于1996年启动了主要针对研究南极嗜冷微生物嗜冷酶的“Coldzyme”项目，研究方向主要包括酶的分子结构适冷机制，酶序列分析、酶分子定向诱变、酶基因克隆表达以及应用开发等方面。另外，他们对低温微生物冷休克蛋白(CSP, cold shock protein)、特殊基因调控系统、特殊膜成分以及不同的分泌机制等方面也进行了重点研究。 我国从20世纪90年代初开始对低温微生物资源(主要是南极及深海微生物)进行初步收集、调查与研究工作。中国水产科学院黄海水产所已研制开发出主要应用于合成洗涤剂方面的海洋低温碱性蛋白酶和应用于医疗方面的低温溶菌酶产品。白玉等从天山多年冻土地区分离、筛选出51株分别具有产低温蛋白酶、低温淀粉酶、低温脂酶、低温β-半乳糖苷酶特性的耐冷菌。在低温微生物的理论和实际应用方面，我国虽起步较晚，但发展极为迅速。相信随着世界各国科学技术的不断进步以及相互交流的增加，我们对低温微生物及其相关产物的研究将取得更加丰硕的成果。
