基本信息
- 项目名称：
- 绵羊肺炎支原体(M.O)外膜蛋白P40基因的克隆和表达
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 绵羊传染性胸膜肺炎是由绵羊肺炎支原体引起的一种慢性呼吸道疾病。 绵羊肺炎支原体结构复杂、培养困难，目前仍缺乏有效的诊断和防治措施，给养羊业带来巨大的经济损失。 本实验在绵羊肺炎支原体培养和鉴定的基础上，通过自制兔抗绵羊肺炎支原体抗体的简接ELISA检测和Western blot初步确定主要的外膜抗原蛋白；根据功能蛋白基因同源性设计引物，扩增外膜蛋白基因，并尝试表达蛋白
- 详细介绍：
- 绵羊肺炎支原体( Mycoplasma.ovi pneumoniae ) 是由Mackay 等于1963 年在英格兰首次从绵羊体内分离到的，它能够引起绵羊和山羊的传染性胸膜肺炎，是以咳嗽、气喘、发烧、渐进性消瘦及肺的间质增生性炎症为特征的慢性呼吸道疾病。 由于绵羊肺炎支原体结构复杂、培养困难，目前仍缺乏有效的诊断和防治措施，给养羊业的经济损失。 研究表明，肺炎支原体蛋白抗原分子为170kD的P1 蛋白质具有抗原性及免疫原性，对粘附及致病原理研究有深远影响[3]。相关文献表明支原体细胞表面蛋白具有特异性与保守性，D. Thirkell 等人 利用SDS—PAGE及western blot 研究发现绵羊肺炎支原体主要膜抗原蛋白分子量为26KD，40KD；进一步应用35S和126I标记技术研究证明26KD 和40 KD 位于细胞的外膜。 本课题在培养和鉴定绵羊肺炎支原体的基础上，首先通过SDS-PAGE分析初步鉴定绵羊肺炎支原体外膜蛋白的分子量范围；然后进行自制兔抗绵羊肺炎支原体抗体的简接ELISA检测和Western blot初步确定主要的外膜抗原蛋白；根据功能蛋白基因同源性设计引物，扩增外膜蛋白P40基因序列，连接克隆载体进行测序，在NCBI比对该基因与猪肺炎支原体基因的同源性达到90%。克隆序列全长1101 bp ,编码367个氨基酸和一个终止子(TAA) ;该序列中含有3 个TGA 编码Trp ，而不是终止密码子。如果继续在原核表达，需要将TGA突变成TGG，然后构建表达载体，尝试蛋白表达。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的: 利用免疫学和克隆基因原核表达的方法，确定表达蛋白的免疫原性,为阐明M.O的致病机理和免疫机制及研究工程疫苗、促进本病诊断技术的发展奠定基础。 基本思路: 1、培养M.O。 2、提取绵羊肺炎支原体全蛋白，制备抗原免疫新西兰兔。 3、简接ELISA测抗体效价，Western blot初步确定主要的外膜抗原蛋白。 4、克隆主要外膜抗原蛋白的基因。 5、表达载体构建及蛋白表达
科学性、先进性及独特之处
- 绵羊肺炎支原体序列的全基因测序，目前国内外研究是通过对绵羊肺炎支原体菌体蛋白进行粗提后，初步鉴定其分子量和免疫原性。 本实验在绵羊肺炎支原体培养和鉴定的基础上，通过自制兔抗绵羊肺炎支原体抗体的简接ELISA检测和Western blot初步确定主要的外膜抗原蛋白；根据功能蛋白基因同源性设计引物，扩增外膜蛋白基因，并尝试表达蛋白
应用价值和现实意义
- 为阐明绵羊肺炎支原体的致病机理和免疫机制以及研究其基因工程疫苗和促进本病诊断技术的发展奠定基础
学术论文摘要
- 绵羊传染性胸膜肺炎是由绵羊肺炎支原体引起的一种慢性呼吸道疾病，由于绵羊肺炎支原体结构复杂、培养困难，目前仍缺乏有效的诊断和防治措施，给养羊业带来了巨大的经济损失。本课题在培养和鉴定绵羊肺炎支原体的基础上，首先通过SDS-PAGE分析初步鉴定绵羊肺炎支原体外膜蛋白的分子量范围；然后进行自制兔抗绵羊肺炎支原体抗体的简接ELISA检测和Western blot初步确定主要的外膜抗原蛋白；根据功能蛋白基因同源性设计引物，扩增外膜蛋白P40基因序列，连接克隆载体进行测序，在NCBI比对该基因与猪肺炎支原体基因的同源性达到90%。克隆序列全长1101 bp ,编码367个氨基酸和一个终止子(TAA) ;该序列中含有3 个TGA 编码Trp ，而不是终止密码子。如果继续在原核表达，需要将TGA突变成TGG，然后构建表达载体，尝试蛋白表达。实验结果：在实验时未做PCR定点突变，成功构建了表达载体PET-28a-40和 PET-32a-40，经ELISA和Western blot确定P40和P30为主要外膜抗原蛋白。
获奖情况
- 2011年河北师范大学课外学术科技创新竞赛二等奖
鉴定结果
- 培养M.O，通过ELISA和Western blot初步确定M.O的主要外膜抗原蛋白是P40、P30；据同源基因的相似性克隆P40；构建PET-28a-40和 PET-32a-40；表达蛋白失败。
参考文献
- 应用技术： 1．简接ELISA实验； 2．Western blot（免疫印迹）实验； 3.分子克隆技术：PCR,胶回收，质粒小提，连T转化，双酶切； 4．表达载体构建； 5．SDS-PAGA电泳制备 。 文献检索目录： 1．中国知识资源总库——CNKI 系列数据库； 2．SpringerLink 3．National Center for Biotechnology Information
同类课题研究水平概述
- 目前，针对绵羊肺炎支原体国外除在诊断、免疫、流行病学及防治方面已进行深入研究外，更多应用了新技术、新方法结合细胞学、生物化学、病理学、免疫学、遗传学及分子生物学进行研究，从而带动了发病机理的研究，取得了支原体研究的很大发展，国内在一些方面虽然取得了一些可喜的进展，但距离国外的研究水平还有很大的差距。到目前为止关于绵羊肺炎支原体的研究还较少，均局限于菌种的分离鉴定，检测技术以较简单的抗原蛋白分析。国内王建昌等采取改良的膜蛋白提取方法，采用SDS¬-PAGE和Western blot分析了绵羊肺炎支原体Y98外膜保护性抗原蛋白成分，利用间接ELSA和MTT法对外膜抗原蛋白引起的细胞免疫和细胞免疫功能进行了鉴定，表明外膜蛋白为绵羊肺炎支原体重要的保护性抗原。
