基本信息
- 项目名称：
- 大型工业丛生用竹——梁山慈竹离体培养及遗传转化研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 造纸业是一个国家的重要产业。但以林木为主的木浆生产所需的纤维原料受到严重限制，而竹浆优于草浆接近于木浆，是造纸优质的纤维原料。由于造纸过程中为脱去木质素而产生的黑液造成严重环境污染。目前在慈竹上克隆了相关木质素合成酶基因，但均未能在竹上得到表达，主要瓶颈在于缺少竹再生体系。因此，本研究建立了梁山慈竹愈伤组织培养与再生体系，并构建梁山慈竹4CLRNAi植物表达载体，通过农杆菌浸染，获得了转基因植株。
- 详细介绍：
- 本研究以梁山慈竹种胚和无菌苗不同部位为外植体，以MS和WPM培养基为基本培养基，附加不同的激素配比，对梁山慈竹组织培养和再生体系进行了研究。同时构建了慈竹木质素合成关键酶基因4CL的RNA干涉载体，并通过农杆菌介导法转化梁山慈竹愈伤组织，最终获得梁山慈竹转基因植株。主要内容如下： 1、梁山慈竹愈伤组织诱导及植株再生体系的建立 以四川泸州梁山慈竹种子为材料，MS和WPM为基本培养基进行种子成熟胚愈伤组织诱导、增殖；丛芽诱导、分化；植株再生；移栽一系列的研究，建立梁山慈竹组织培养及植株再生体系。 2、慈竹4CL RNAi载体的构建 从慈竹幼笋cDNA中克隆Na4CL基因（Genbank：EU327341）保守区约600 bp片段，利用中间载体pSK-int和植物双元载体pBI121上的酶切位点，构建慈竹4CL基因的RNAi植物表达载体pBI-4CL-RNAi。 3、慈竹4CL RNAi植物表达载体对梁山慈竹的遗传转化研究 将构建好的pBI-4CL-RNAi质粒利用农杆菌介导法侵染梁山慈竹愈伤组织，对筛选培养基上抗性愈伤组织进行PCR检测。 研究结果表明，MS诱导效果优于WPM，MS2培养基更有利于愈伤组织的发生。采用农杆菌介导法侵染梁山慈竹愈伤组织，筛选一个月后，获得了抗性愈伤组织。PCR检测初步证明RNAi载体已导入梁山慈竹抗性愈伤组织基因组中，为获得木质素含量降低的梁山慈竹转基因植株，纸浆用竹改良和竹功能基因组学研究奠定基础。
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撰写目的和基本思路
- 在纸浆生产过程中为了脱去木质素而耗费了大量的能源和原料，产生的造纸黑液严重污染环境，制约着造纸业的发展。我国西南地区拥有丰富的竹子资源。竹纤维优于草浆接近于木浆，降低木质素或改变其组分，有利于我国竹子造纸业进入一个崭新的阶段。竹遗传转化研究的主要瓶颈在于缺少竹离体愈伤组织诱导与植株再生体系。因此，本研究建立梁山慈竹愈伤组织培养及再生体系。力求通过遗传转化的方法为造纸业发展寻找新的方法和途径。
科学性、先进性及独特之处
- 前人有关改良梁山慈竹基因组的研究都停留在理论阶段。由本研究建立的梁山慈竹再生体系对竹类改良和竹功能基因组研究和创造适合我国国情的环保型低木质素的纸浆用竹奠定基础。本课题以梁山慈竹为研究对象，运用RNA干涉技术调控靶基因4CL的表达。梁山慈竹的4CL基因转导技术在本土梁山慈竹中成功的应用，在梁山慈竹的改良史上是首例，扩大了 4CL基因的应用范围。
应用价值和现实意义
- （1）为竹的遗传转化研究奠定了基础。 （2）为竹类改良和竹功能基因组学研究提供了平台。 （3）为创造适合我国国情的环保型纸浆用竹提供了依据。 （4）同时，本研究还可用于编织、纺织等行业，完善产业链。有利于生态保护，带来巨大经济效益。
学术论文摘要
- 梁山慈竹是生产竹浆的优良纤维原料，但在竹浆生产过程中为了脱去竹木质素加入大量的强酸强碱等化工原料，造成成本增加和环境污染。通过生物技术手段培育木质素含量低的竹种，具有巨大的经济效益和环境效益。竹类遗传转化的主要瓶颈在于缺少竹再生体系。本研究以梁山慈竹种胚和无菌苗不同部位为外植体，对梁山慈竹组织培养和再生体系进行了研究，同时构建了慈竹木质素合成关键酶基因4CL的RNA干涉载体，并通过农杆菌介导法转化梁山慈竹愈伤组织，最终得到转基因再生植株。 组织培养结果表明：MS2培养基更有利于愈伤组织的发生。种胚接种3天后开始膨大，进入愈伤组织诱导启动期；15天左右进入分裂期；30天后进入分化期，形成疏松易碎、增殖能力强的颗粒状愈伤组织，发生率高达96%。在MS2上，以梁山慈竹无菌苗不同部位为外植体也能诱导出愈伤组织，并形成再生植株，嫩芽和幼嫩带节茎段诱导效果较好。 采用农杆菌介导法侵染梁山慈竹愈伤组织，获得了抗性愈伤组织，最终得到转基因再生植株。经PCR检测证明采用RNAi技术已将4CL基因导入梁山慈竹再生植株，为纸浆用竹的改良和竹功能基因组学研究奠定了基础。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] 魏建华, 宋艳茹. 木质素生物合成途径及调控的研究进展[J]. 植物学报, 2001, 43(8): 771-779. [2] 胡尚连, 曹颖, 贾举庆. GA3对慈竹木质素和纤维素动态积累及PAL酶活性调控的效应[J]. 湖北农业科学, 2008, 47(8): 930-932. [3] Marita J M, Ralph J, Hatfield R D, Chapple C. NMR characterization of lignins in Arabidopsis altered in the activity of ferulate 5-hydroxylase[J]. P NATL ACAD SCI USA, 1999, 96: 12328-12332. [4] Ralf Möller, Diane Steward, et.al. Gene silencing of cinnamyl alcohol dehydrogenase in Pinus radiata callus cultures[J]. PLANT PHYSIOL BIOCH, 2005, 43: 1061-1066. [5] 曾荣, 罗学刚, 谭向红, 等. 竹木质素研究进展[J]. 四川农业大学学报, 2004, 22(3): 274-277. [6] 贾举庆, 胡尚连, 孙霞, 等. 四川2种丛生竹木质素和纤维含量的研究[J]. 西北植物学报, 2007, 27(1): 197-200. [7] 张猛, 胡尚连, 贾举庆. 施肥对慈竹灰分苯醇抽出物和木质素含量的影响[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(1): 246-247. [8] 胡尚连, 曹颖, 卢学琴, 等. 氮钾对慈竹纤维素和木质素动态积累的调控效应[J].植物研究, 2009, 29(6): 728-733. [9]胡尚连, 曹颖, 贾举庆. GA3对慈竹木质素和纤维素动态积累及PAL酶活性调控的效应[J]. 湖北农业科学, 2008, 47(8): 930-932. [10] 范丙友, 陆海, 蒋湘宁. 维管植物4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)研究进展[J]. 林业科学, 2007, 43(2): 96-103.
同类课题研究水平概述
- 1．竹类木质素生物合成相关酶基因的研究现状 与其他植物相比，竹类植物木质素生物合成酶相关基因的研究十分滞后。目前仅在慈竹、绿竹、毛竹上有相关基因克隆的报道。 已从绿竹中克隆了BoCCoAOMT1和BoCOMT1基因 ，从毛竹中克隆了一个CCoAOMT1、CCoAOMT2、C4H和4CL基因 ，5个CCR基因、5个CAD基因、1个C3H基因。 2008年和2010年本研究室从大型丛生竹慈竹中分别成功克隆了一个4CL基因全长编码序列（GenBank ：EU327341）。但以上研究所获得的相关竹木质素合成酶基因均未能在竹上得到表达、验证与应用，尤其是在大型工业纸浆用竹上。制约竹相关基因表达与调控及其在遗传改良方面应用的主要瓶颈在于缺少竹离体愈伤组织诱导与植株再生体系，尤其是遗传转化体系。因此，建立工业纸浆用大型丛生竹离体培养再生体系和遗传转化研究十分必要。 2.RNAi在遗传转化中的应用 结果显示:转基因植株Klason木质素含量与对照相比平均降低了9.86%,综纤维素含量与对照相比平均增加了3.17%,纤维长宽比明显增加,均表明转基因植株更有利于造纸。Li等利用RNAi技术研究了棉花纤维细胞伸长过程中的细胞骨架肌动蛋白的作用。结果显示：在目的基因被沉默的阳性植株中，mRNA和相关蛋白质含量显著降低，纤维中细胞骨架也遭到破坏，纤维的伸长也被特异性抑制。 3.4CL基因的研究现状 胡尚连、曹颖等参照其他物种4CL基因保守区,设计简并引物,以慈竹幼笋cDNA为模板,克隆到1条750 bp的4CL基因保守区片段。以这条保守区片段为模板,结合5′RACE和3′RACE克隆4CL基因全长序列,并对其进行了生物信息学分析。结果成功克隆了慈竹4CL基因全序列,并在GenBank上注册为EU327341。黄圣雄、胡尚连等利用收集得到的50条4CL基因完整cDNA序列，构建了4CL基因的系统发生树,揭示了4CL基因的保守性和分化的事实。周建英等人通过RNAi技术将pSK-4CL-RNAi表达载体转入烟草中并明显降低了烟草的木质素含量。李良、王小兵等人通过研究麦芽、丝瓜、土豆、大豆4CL基因活性，并与4种植物中总黄酮和总木质素的含量进行相关性分析，结果表明：4CL活性与总黄酮含量呈正相关关系而与总木质素含量呈一定的负相关关系。
