基本信息
- 项目名称：
- 兔皮中6种条件性致病菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 动物皮毛中含有大量细菌，有一部分细菌为人畜共患，对从事皮毛加工人员的身体健康构成了很大威胁。16S rDNA是细菌系统分类研究中最常用的分子钟，种类少、含量大、分子大小适中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域。本研究以此为指导，以细菌的16s rDNA为研究目标，采用PCR-RFLP技术，对兔皮中分离到的6种细菌在分子水平上进行鉴定，以期开发出一种准确、快速的检测方法。
- 详细介绍：
- 动物皮毛中含有大量的细菌，多数情况下为非致病菌，但也有一部分细菌为人畜共患。这些有害细菌的存在对于从事皮毛加工人员的身体健康构成了很大的威胁。 16S rDNA是细菌的系统分类研究中最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80％），分子大小适中。16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是 18S rRNA ）中，在结构与功能上具有高度的保守性。然而在16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域。根据各种细菌的16S rDNA可变区进行细菌鉴定已应用到各领域的微生物鉴定中。 PCR-RFLP是将PCR方法与限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）相结合的一种技术，其首先是进行PCR，然后对PCR产物进行限制性分析，结果是以RFLP图谱的形式表现出来。通常情况下应用PCR-RFLP能够将细菌鉴定到种甚至是亚种，少数细菌可鉴定到属。 本研究以细菌的16s rDNA为研究目标，采用PCR-RFLP技术，对兔皮中分离到的6种细菌在分子水平上进行鉴定，以期开发出一种准确、快速的检测方法。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 甘肃省是我国皮毛进出口贸易大省，但动物皮毛中含有的大量致病菌会对从事皮毛加工人员的身体健康构成了很大威胁，而且如果进境皮毛带有致病菌，也会通过感染对我省人畜造成极大影响。为了尽量降低皮毛中细菌对加工人员和我省人畜造成的伤害，就要对动物皮毛进行一种快速检测，检查其是否带有致病菌，以保证人畜安全。本研究以此为出发点，希望能找出一种快速有效的检测方法，从而为这种方法投入使用提供切实可行的理论依据。
科学性、先进性及独特之处
- PCR-RFLP是将PCR方法与RFLP方法相结合的一种技术，通常情况下应用PCR-RFLP能够将细菌鉴定到种甚至是亚种，少数细菌可鉴定到属。本研究以细菌的16s rDNA为研究目标，采用PCR-RFLP技术，对兔皮中分离到的6种细菌在分子水平上进行鉴定，以期开发出一种准确、快速的检测动物皮毛中致病菌的方法，能对皮毛快速检测方法的开发提供理论依据。
应用价值和现实意义
- 我省的动物皮毛贸易近几年在全国迅速发展，尤其是皮毛进出口贸易取得了快速进步。但动物皮毛中一旦检出致病菌，就要进行焚烧等处理，不仅造成经济上的损失，而且一旦感染人畜，造成的影响是不能估计的。 如果能找出一种快速有效检测致病菌的方法，并将其开发成试剂盒，对于质量监察检验部门和出入境检验检疫部门来说将极大地减轻他们用老方法检验的工作量，而且将对人畜伤害降到最低。
学术论文摘要
- 对分离自进口兔皮中的6种细菌，即莫拉菌属、肺炎克雷伯菌、皮氏罗尔斯顿菌、产色葡萄球菌、睾丸酮丛毛单胞菌、嗜铜菌属，分别进行基因组DNA提取，然后以所提取的DNA为模版，用16s rDNA的通用引物27f和1492r进行PCR扩增。6种菌的PCR扩增产物以17种内切酶，即AvaI、BamHI、BgⅡ、DraI、EcoRI、EcoRⅡ、HindⅢ、Hinf、HpaI、PstI、SmaI、TaqI、XbaI、XmaI、AluI、XhoI、PvuI进行酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，每种细菌都形成了种特异的16s rDNA RFLP指纹。结果表明该方法是一种快速、可靠的细菌分析、鉴定方法，可应用于这6种菌的鉴定。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 经鉴定，该论文研究处于目前国内外相关研究前列，且对我省皮毛进出口贸易有很重要的意义，同意推荐。
参考文献
- [1] Chinnaswamy,et al. Genetic diversity of native Bradyrhizobia isolated from soybeans(Glycine max L.) in different agricultural- ecological-climate regions of India[J]. Applied and environmental microbiology, 2008,1. [2] Hector Toledo,et al. Tetracycline resistance in Chilean clinical isolates of Helicobacter pylori. J. Antimicrob. Chemother., Mar 2010, 65. [3] Christian Michel,et al. Diversity of lactic acid bacteria associated with fish and the fish farm environment, established by amplified rRNA gene restriction analysis. Applied and environmental microbiology,2007, 73(9). [4] Ya-Sung Yang,et al. Recurrent Klebsiella pneumoniae Liver Abscess: Clinical and Microbiological Characteristics. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. 2009, 47(10). [5] Joyce, et al. Pyogenic Liver Abscesses Caused by Klebsiella pneumoniae: US Appearance and Aspiration Findings. Radiology, 2007, 242(3).
同类课题研究水平概述
- 传统的微生物分类鉴定是依赖纯培养分离方法，通过表型特征和细胞形态学的观察，对其生理生化反应和细胞组成成分结构进行比较分析来鉴定。但自然环境中有相当多的菌种用纯培养方法无法培养出来。而且纯培养分离方法使用配比简单的营养基质和固定的培养温度，忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差更使得可培养的种类大大减少。 16S rDNA是编码16S rRNA的基因，在细菌的16S rDNA中有多个区段高度保守，根据这些保守区人们可以设计出细菌的通用引物，可以用来扩增出所有细菌的16S rDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16S rDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。 在分类鉴定一些特殊环境下的微生物时，由于分离培养技术的限制，难以获得它们的纯培养进行生理生化学等指标的分析，这样16S rDNA序列分析技术的优越性就体现出来了。 PCR-RELP是根据16S rRNA基因的保守区设计通用引物，其中一个引物5’端用荧光物质标记，提取待分析样品的总DNA，以它为模板进行PCR扩增，所得到的PCR产物一端就带有这种荧光标记，然后将PCR产物用合适的限制性内切酶消化。由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生许多不同长度的限制性片段。消化产物用自动测序仪进行检测，只有末端带荧光标记的片段能被检测到，而其他没有带荧光标记的片段则检测不到。这些末端标记的片段就可以反映微生物群落组成情况，因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的细菌，也就是说一种末端限制性片段至少代表一种细菌。 目前国内外单独对16S rDNA 或RFLP这两种理论技术分开研究虽然较多，但将它们结合在一起进行16S rDNA PCR-RFLP指纹图谱的研究仅查到几篇报道，并且都是对土壤和乳制品中的微生物进行分离检测。目前国内外对于运用16S rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法进行动物皮毛中致病菌的研究还无人问津。因此，我们首次将这种技术应用到动物皮毛致病菌的研究中，希望能为快速检测动物皮毛中的致病菌提供理论依据，并因此为切入点开发出快速检测试剂盒，来取代现在传统的培养检测方法。
