基本信息
- 项目名称：
- 商陆提取物抑菌活性评价研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本作品采用不同方法提取商陆活性成分，研究这些提取物的体外抑菌活性。首先采用琼脂扩散法测定不同的商陆提取物对临床常见的15 株病原菌的抑菌圈，筛选出有用的病原菌（商陆对其有抑制效果），再采用液体稀释法对上述病原菌进行最小抑菌浓度的测定，并重复多次。其目的在于探讨商陆的有效抑菌活性成分，为商陆的进一步开发奠定基础，也为商陆的用量提供参考。
- 详细介绍：
- 我们用不同方法提取商陆活性成分，研究这些提取物的体外抑菌活性。首先采用琼脂扩散法测定不同的商陆提取物对临床常见的15 株病原菌的抑菌圈，筛选出有用的病原菌（商陆对其有抑制效果），再采用液体稀释法对上述病原菌进行最小抑菌浓度的测定，为进一步开发源于商陆的植物杀菌药物奠定了理论基础。同时，也为商陆的用量提供参考。我们采用不同的方法对商陆不同提取物的抑菌程度进行测定，并重复多次，确保数据的准确性。 1 材料 1.1 商陆饮片：购于浙江中医药大学饮片厂。 1.2 供试病原菌： 金黄色葡萄球菌（25923）、大肠埃希菌（25922）、铜绿假单胞菌（27853）由本室保存。产气荚膜梭菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门菌、肺炎克雷伯菌、志贺菌、肠球菌、甲型副伤寒菌、乙型副伤寒菌、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、白假丝酵母和新生隐球菌由浙江中医药大学附属第一医院检验科细菌室提供。 1.3 试剂和仪器： D101大孔树脂（上海摩速科学器材有限公司，20091010）；正丁醇（浙江杭州双林化工试剂厂，20090212，分析纯）；香草醛（上海双香助剂厂，20090718，分析纯）；浓硫酸（中国杭州化学试剂有限公司，20081109，分析纯）；薄层硅胶G（青岛海洋化工有限公司，20090103，分析纯）。旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司，R-201）；精密电子天平（奥豪斯国际贸易上海有限公司，AR520）；普通冰箱（海尔集团，BCD-205E/Y）；手提式压力蒸汽灭菌器（上海医用核子仪器厂，YXQ.SG4.280型）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司，DHG-9070A型）。 1.4 培养基： MH培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化钠0.5%，琼脂2%。 沙氏培养基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，琼脂2%。 2 方法 2.1 商陆不同提取物的制备： 2.1.1商陆水煎液：称取商陆饮片100 g，加蒸馏水煮沸提取3次，每次1 h，液料比为10:1。合并提取液，干净纱布过滤，滤液浓缩至100 ml，即每1 ml含生药1 g，4℃保存，备用。 2.1.2 商陆粗多糖提取物：称取商陆饮片100 g，粉碎后加蒸馏水80℃水浴提取3次，每次2 h，液料比为10:1。合并提取液，干净纱布过滤，滤液浓缩至一定体积后加入等体积5%三氯乙酸，充分混匀后离心去除蛋白质沉淀，上清液浓缩至一定体积，缓慢加入95%乙醇制备成乙醇终浓度为80%的溶液，4℃静置8 h，4000 rpm离心15 min，沉淀用无水乙醇洗涤3次，60℃烘干，备用。 2.1.3 商陆粗总皂苷提取物：称取商陆饮片100 g，加60%乙醇回流提取3次，每次2 h，液料比为10:1。合并提取液，干净纱布过滤，滤液浓缩至一定体积后用水饱和正丁醇反复萃取，合并正丁醇层，减压蒸馏浓缩，60℃烘干,备用。 2.1.4 不同极性商陆皂苷提取物：称取商陆饮片100 g，加60%乙醇回流提取3次，每次2 h，液料比为10:1。合并提取液，干净纱布过滤，滤液浓缩至一定体积，用D101大孔树脂吸附过夜，装柱。先用蒸馏水将吸附在树脂上的糖洗脱干净，然后分别用30%、60%、90%乙醇溶液各2000 ml梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩至一定体积，用水饱和正丁醇充分萃取，减压蒸馏浓缩，60℃烘干备用。 2.2 商陆不同提取物的鉴定 2.2.1 商陆粗多糖定性鉴别：取干燥的粗多糖0.1 g加2 ml蒸馏水溶解，加入含15%α-萘酚的乙醇溶液2 ml，充分混匀，沿试管壁缓缓加入0.5 ml浓硫酸，液层交界处如出现紫色环，说明化合物为糖类。 2.2.2 商陆粗皂苷定性鉴别：茚三酮试剂反应呈阴性，基本排除蛋白、多肽或氨基酸类物质；醋酐-浓硫酸显色反应呈红棕色；在以羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上以氯仿-甲醇-水(7:3:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷香草醛-浓硫酸，105℃烘烤2 min，出现蓝紫色斑点，说明化合物为皂苷类。 2.3 琼脂扩散法测定抑菌圈： 2.3.1 将在56℃左右恒温的无菌MH琼脂倾注于直径为90mm的平板中，使琼脂的厚度为4mm（大约25ml） 2.3.2 菌株活化后，新鲜的菌株用无菌水校正至0.5麦氏比浊单位（相当于1.5*108cfu/ml），作为供试菌液。 2.3.3 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60度）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。 2.3.4 用记号笔在平板底部将平板划分成四等分，然后用直径6 mm打孔器在每份中央打孔，去除孔内琼脂。 2.3.5 盖上平板的盖子，放置3-10分钟。各提取物样品用少量无菌水或二甲基亚砜溶解后加于孔中，以满而不溢为宜并作好标记，同时以MH肉汤作为阴性对照。37℃培养18～24 h，观察有无抑菌圈。 2.4 微量液体稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）： 2.4.1 菌株活化后，采用刚刚培养18-24h的菌株，用无菌水校正至0.5麦氏比浊单位，然后1:200稀释，使菌液浓度为105 cfu/ml。 2.4.2 各提取物样品用无菌水或二甲基亚砜溶解后，用MH液体培养基进行对倍稀释。 2.4.3 在微量聚乙烯孔板中加入各种不同浓度的样品100 l，并接种100 l稀释好的各菌液，同时设立菌液对照和样品对照，做好标记，盖上盖板。 2.4.4 37℃培养24 h，观察各孔中培养液的浊度，将孔底部不出现细菌沉淀的最低浓度作为该样品对细菌的最小抑菌浓度。 2.4.5 将培养24h后的微量聚乙烯孔板中的每孔液体分别接种于无菌MH琼脂培养基上，盖上平板盖，37℃培养24h，观察液体里细菌生长情况。 2.4.6 将肉眼观察结果与接种于MH琼脂培养基的液体里细菌生长情况进行比较，得出最后的结论（以后者的结果为主）。 3 结果 3.1 琼脂扩散法测定抑菌圈： 用琼脂扩散法测定不同商陆提取物对15种常见病原细菌的抑菌活性。结果显示，商陆水煎液对不动杆菌、白假丝酵母、新生隐球菌有抑菌活性；商陆粗多糖对产气杆菌、志贺菌有抑菌活性；商陆粗总皂苷对不动杆菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门菌、志贺菌、枯草芽孢杆菌、新生隐球菌有抑菌活性；商陆皂苷30%乙醇提取物对产气荚膜梭菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、志贺菌、甲型副伤寒菌、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、白假丝酵母都有抑菌作用；商陆皂苷60%和90%乙醇提取物对供试菌株无明显抑菌活性。 3.2 微量液体稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)： 用微量液体稀释法测定具有抑菌活性样品的MIC值，商陆水煎液对新生隐球菌的MIC为62.5 mg/ml，对不动杆菌和白假丝酵母的MIC为500.0 mg/ml；商陆粗多糖对志贺菌的MIC为7.5 mg/ml，对产气荚膜梭菌的MIC为60.0 mg/ml；商陆粗总皂苷对枯草芽孢杆菌的MIC为4.5 mg/ml，对铜绿假单胞菌和新生隐球菌的MIC为9.0 mg/ml，对志贺菌的MIC为18.0 mg/ml，对不动杆菌和伤寒沙门菌的MIC为36.0 mg/ml；商陆皂苷30%乙醇提取物抗菌谱最广，对大肠埃希菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌、志贺菌、枯草芽孢杆菌的MIC值为17.6 mg/ml，对产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、甲型副伤寒菌、普通变形杆菌的MIC值均为35.3 mg/ml，对白假丝酵母的MIC值为70.0 mg/ml。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：本作品研究植物商路的不同提取物的体外抑菌作用，探讨商陆的有效抑菌活性成分，为商陆的进一步开发奠定基础。 基本思路：我们用不同方法提取商陆活性成分，研究这些提取物的体外抑菌活性。首先采用琼脂扩散法测定不同的商陆提取物对临床常见的15 株病原菌的抑菌圈，筛选出有用的病原菌（商陆对其有抑制效果），再采用液体稀释法对上述病原菌进行最小抑菌浓度的测定，并重复多次。
科学性、先进性及独特之处
- 滥用抗生素加快了耐药细菌的产生，尤其是“超级细菌”耐药谱广泛，寻找新的抗菌药物迫在眉睫。而抗菌中药的最大优点是不易产生耐药性。探索抗菌中草药，进行深入的研究其抑菌成分，有望研制新一代抗菌制剂，为耐药细菌的治疗提供新的方向。 我们采用不同的方法对商陆不同提取物进行体外抑菌试验。经研究，发现商陆的主要成分皂苷的抑菌效果较明显。研究结果为进一步开发源于商陆的植物杀菌药物奠定了基础。
应用价值和现实意义
- 研究发现商陆对许多病原细菌和真菌有抑制生长的作用，可以开发成抗菌药物。再者，商陆的制作工艺比抗生素要简单，副作用低，可以增强免疫力，联合抗生素使用可以消除抗生素的不良反应。深入研究有望研制源于商陆的植物杀菌药物，发展前景可观，具有良好的经济前景和社会价值。
学术论文摘要
- 目的：探讨商陆的有效抑菌活性成分。 方法：采用琼脂扩散法测定不同商陆提取物对临床常见的15株病原菌的抑菌圈；采用液体稀释法测定最小抑菌浓度。 结果：商陆不同粗提物对病原菌有不同程度的抑制作用，商陆水煎液仅对不动杆菌、白假丝酵母、新生隐球菌有一定抑制作用，最小抑菌浓度分别为500.0 mg/ml、500.0 mg/ml和62.5 mg/ml，抑菌作用不明显；多糖提取物仅对产气荚膜梭菌、痢疾志贺菌有一定抑制作用，最小抑菌浓度为60.0 mg/ml和7.5 mg/ml；商陆皂苷30%乙醇提取物抑菌效果较明显、抗菌谱较广，对产气荚膜梭菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、志贺菌、甲型副伤寒菌、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、白假丝酵母均有抑菌作用，最小抑菌浓度范围为17.6 mg/ml～70.0 mg/ml；商陆皂苷60%和90%乙醇提取物无抑菌活性。结论：商陆抑菌活性主要有效部位为极性较大的皂苷类提取物。
获奖情况
- 向《中国现代中药》投稿，已修回，拟录用。
鉴定结果
- 已通过审核
参考文献
- 1.杨帮,丁伟,赵志模,等.美洲商陆和姜黄提取物抑菌活性的研究J.西南农业大学学报[J].2005,27(3): 297-304． 2.张巧艳，郑汉臣,易杨华,等.商陆属植物皂苷类成分及其药理活性.国外医药（植物药分册）.2000,15(3):104—107 3.刘爽,杨爱国,赵琦,等.美洲商陆抗真菌蛋白转化玉米的研究和抗病性检测.玉米科学.2007,15(2): 31～35,38 4.陈国菊,雷建军,曹必好.商陆抗病毒蛋白在植物抗病上的应用.长江兹菜（学术版）.2009,（20）：5－8 5.吴决,顾世海,王立霞.抗茵性中药药物敏感试验方法研究.北华大学学报(自然科学版).2000,1(6):489-491 6. 何明张,永跟.中药抑菌作用研究现状.北京中医药大学学报(中医临床版).2007,14(6):44-46 7.黄秀凤.中药提取物及其化学成分抑菌作用的研究进展.中国药物与临床.2007,7(5):370-371
同类课题研究水平概述
- 从1948年Kassanis等从商陆中提取得到一种抗病毒的糖蛋白后，商陆中的抑菌化学成分逐渐受到国内外学者关注[1] 。随后，在1997年，Zoubenko O[2]等在研究商陆抗病毒蛋白（PAP）时，发现 PAP除了抗植物病毒和动物病毒活性以外，还对真菌和细菌的活性有一定的抑制作用。 在2003年，贾金萍[1]等人在山西医科大学学报上发表了商陆多种提取物对病菌的抑菌效果。紧接着，在2005年，杨帮[3]等对美洲商陆的多种溶剂提取物进行真菌的抑制实验，证明了其甲醇提取物对柑橘绿霉和小麦纹枯2种病原菌有较强的抑制作用。 从20世纪40年代，我国就开始进行传统中药的体外抑菌实验，证明了一大批中药对各种细菌有抑制作用。1998年，杜渝平[4]等对黄连等多种中药进行体外抑菌活性研究，发现能够抑菌的单味中药有很多，且能够抑制多种菌属。随后，在2002年，温燕[5]等进行动物试验研究，表明鱼腥草具有抗菌、消炎、解热止咳作用，对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌等具有明显抑制作用，且能增强血白细胞的吞噬能力，收到了较好的临床疗效。 参考文献： [1]贾金萍,秦雪梅,李青山．商陆化学成分和药理作用的研究进展．山西医科大学学报[J] ．2003,34(1): 89-92． [2] Zoubenko O, Uckun F, Hur Y, et al. Plant resistanceto fungal infection induced by nontoxic pokeweed antiviral protein mutants [J]. Nature Biotechnology, 1997,15 (10):992-996. [3]杨帮,丁伟,赵志模,等.美洲商陆和姜黄提取物抑菌活性的研究J.西南农业大学学报[J].2005,27(3): 297-304． [4] 杜渝平，卢仙娥，邓济更等. 医院感染菌的抗生素与抗菌中药敏感性的对比研究.重庆医学，1998,27(1):33-34 [5] 温燕, 刘文辉. 鱼腥草注射液治疗肺部感染48例[J]. 新中医, 2002, 34( 7) : 65
