基本信息
- 项目名称：
- 生物冶金微生物与重金属生物处理微生物基因工程改造及相关机理研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 喜温硫杆菌是生物冶金主要的硫氧化细菌之一。本研究团队利用细菌结合转移方法实现了外源基因对该菌的转移操作，之后针对该菌又建立了更为便捷高效的外源基因电转方法，对喜温硫杆菌进行基因改造，提高其生长和氧化速度。 有色金属矿经常含有较多的重金属元素。金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸的低分子量金属结合蛋白。我们合成了金属硫蛋白基因，把它转入大肠杆菌，构建了对重金属有强亲和力的基因工程菌，取得了很好的效果。
- 详细介绍：
- 生物冶金的主要缺点是菌的氧化速度慢，生长慢，矿物处理时间长。利用基因工程的方法改造浸矿菌的氧化代谢途径，提高菌种的矿物氧化速率和生长速率，才能从根本上解决生物冶金效率低的问题。生物冶金过程中，细菌对铁和硫的生物氧化是与金属浸出最直接相关的生化反应过程。 喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）是生物冶金主要的硫氧化细菌之一。该菌是极端适酸性自养微生物，最适生长pH 2左右，在pH低于1的条件下仍能很好地生长；该菌不利用有机物，通过氧化单质硫或硫化物获得能量并固定二氧化碳进行生长。该菌具有独特的生理特性，目前常规的基因转移方法均无法实现对该菌的基因操作。本研究团队利用细菌结合转移方法率先在国际上实现了外源基因对该菌的转移操作，之后针对该菌又建立了更为便捷高效的外源基因电转方法，是国际上唯一成功对该菌进行遗传改造的研究团队。本研究将利用电转方法对喜温硫杆菌进行基因改造，提高其生长和氧化速度。 嗜铁钩端螺旋菌（Leptospirillum ferriphilum）是生物冶金过程中重要的铁氧化菌。该菌也是极端适酸性自养微生物。该菌通过氧化亚铁离子（Fe2+）获得能量并固定二氧化碳进行生长。铁氧化细菌和硫氧化细菌相互配合才能使生物冶金过程高效进行。现在认为生物冶金过程包括直接氧化和间接氧化机理。直接氧化是微生物吸附到矿石表面直接氧化矿石，从矿石上得到电子；而间接氧化是指溶液中的高价离子氧化矿物变成低价离子，而微生物的氧化作用是使这些低价离子再生为高价离子使氧化反应不断进行。直接氧化离不开微生物对矿石的吸附，而目前对于这方面的研究还不够细致，大多使用单菌进行实验，与实际生产状态有很大差别；少数实验使用混合菌，但只知道混合菌的总数，无法获得两种菌的比例。为此，本研究将利用分子生物学的定量PCR技术，确定两种菌的吸附比例并建立相应的吸附模型。 有色金属矿经常含有较多的重金属元素。近年来，随着我国优质矿石的不断减少、枯竭，不得不开发利用难冶矿。以金矿为例，含砷（As）和黄铁矿的金矿石在我国占有很大比例。砷具有很大的毒性，俗称砒霜的成分就是三氧化二砷。传统火冶方法会使砷变为蒸发进入空气，导致工人严重中毒并污染大气。国家已经明文规定高含砷金矿不能采用火冶的传统冶金工艺。采用生物冶金工艺，砷变为离子进入溶液，经过沉淀、吸附等处理可以去除液体中的砷，使废水达到排放标准。对于高重金属浓度废水可以采用化学沉淀法。由于重金属的危害性极大，国家建立了严格的排放标准。对于含低浓度重金属废水，加入大量化学试剂后，化学试剂本身就构成了污染，并且也不经济。采用生物吸附法能够避免化学试剂污染，是可行的方法。然而，由于存在吸附平衡，在重金属浓度很低的情况下，如果吸附剂对重金属的亲和性不够高，多数重金属离子就不会被吸附。金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸的低分子量金属结合蛋白。我们合成了金属硫蛋白基因，把它转入大肠杆菌（E. coli），构建了对重金属有强亲和力的基因工程菌，取得了很好的效果。为了提高金属硫蛋白在重组大肠杆菌中的表达量，我们将多个金属硫蛋白基因串联起来进行表达，亦取得了理想的结果。为了能够监测金属硫蛋白的表达，我们将红色荧光蛋白与金属硫蛋白串联表达，使表达金属硫蛋白基因的重组大大肠杆菌变为红色。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 金属硫蛋白对重金属有很高的亲和性，在生物体内发挥重金属解毒等多种生理功能。把金属硫蛋白基因转入大肠杆菌，可以有效解决生物冶金效率低的问题。我们利用基因改造技术，对浸矿微生物进行了遗传改造，促进了菌体生长和代谢活性；研究了混合浸矿微生物对矿物的吸附机理，提出了新的吸附模型用于指导生物冶金工艺优化；最后，构建了对重金属具有高亲和力的表达金属硫蛋白的大肠杆菌，作为冶金废水重金属的高效生物吸附剂。
科学性、先进性及独特之处
- 本研究团队利用细菌结合转移方法率先在国际上实现了外源基因对喜温硫杆菌的转移操作，建立了外源基因电转方法，提高其生长和氧化速度。 利用分子生物学手段，建立了新的微生物吸附模型，可用于指导生物浸出工艺设计、工艺条件优化以及工艺技术放大。 成功构建了金属硫蛋白串联表达载体，提高了金属硫蛋白的表达效率以及工程菌对重金属As(III)等的吸附能力；引入红色荧光蛋白对金属硫蛋白的表达过程进行监测。
应用价值和现实意义
- 利用基因工程技术构建了生长代谢更旺盛的浸矿菌株，有助于提高浸矿活性，缩短浸矿周期，提高生产效率，降低生产成本。 提出混合浸矿微生物竞争吸附模型，可用于指导生物冶金工艺优化、工艺设计。 构建了高效串联表达金属硫蛋白基因的质粒载体，并转入大肠杆菌构建了重金属高亲和力生物吸附剂，可以高效率地去除水中低浓度的重金属。
学术论文摘要
- 嗜铁钩端螺旋菌与喜温硫杆菌是生物冶金过程中铁和硫氧化的重要嗜酸性细菌。本研究中，我们报道了嗜铁钩端螺旋菌LF-104与喜温硫杆菌MTH-04二元混合菌群对黄铁矿表面的竞争吸附。研究结果表明，嗜铁钩端螺旋菌的吸附未受喜温硫杆菌的影响，但喜温硫杆菌的吸附却受嗜铁钩端螺旋菌的严重影响；嗜铁钩端螺旋菌比喜温硫杆菌对黄铁矿有更高的电作用力。基于上述结果，我们提出了竞争吸附模型，解释嗜铁钩端螺旋菌与喜温硫杆菌对黄铁矿的竞争吸附机制。上述过程中嗜铁钩端螺旋菌处于主导地位。 金属硫蛋白（MTs）是一类金属结合蛋白。为了吸附重金属，本文构建了表达人金属硫蛋白（hMT-A）基因的大肠杆菌。为了增加蛋白质的稳定性，谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因与hMT-A基因融合表达。为了增加金属硫蛋白表达效率和金属结合容量，分别将两个、三个和四个金属硫蛋白基因串联连接，并在大肠杆菌中表达。表达GST融合三个串联hMT-A基因的重组大肠杆菌表现了最大的镉（Cd(II)）和砷（As(III)）生物吸附活性，分别达到 6.36 mg Cd/g dry cell和7.59 mg As/g dry cell。
获奖情况
- 1. Ma Y, Lin J, Zhang C, Ren Y, Lin J,Cd(II) and As(III) bioaccumulation by recombinant Escherichia coli expressing oligomeric human metallothioneins, journal of hazardous materials 185 (2011) 1605-1608 (SCI影响因子 4.144) 2. Song J, Lin J, Ren Y, and Lin J, Competitive adsorption of binary mixture of Leptospirillum ferriphilum and Acidithiobacillus caldus onto pyrite, Biotechnology and Bioprocess Engineering 15：923-930 (2010) (SCI影响因子 1.412) 3. Gao L, Ren Y, Lin J, Lin J, 2011, Modeling and simulation of production of metallothionein and red fluorescent fusion protein by recombinant E. coli using graphical programming, in: Labview - Modelling, Programming and Simulations. Intech Press.
鉴定结果
- 混合浸矿微生物竞争吸附模型，可用于指导生物冶金工艺优化、工艺设计；构建了高效串联表达金属硫蛋白基因的质粒载体，并转入大肠杆菌构建了重金属高亲和力生物吸附剂，可以高效率地去除水中低浓度的重金属。
参考文献
- [1] 杨显万，沈庆峰，郭玉霞, (2003). 难处理金矿的细菌氧化预处理. 微生物湿法冶金. pp165-167. [2] 杨洪英，杨立.（2000）.细菌氧化难浸金矿石的矿物学研究探讨. 有色金属. 52（1）：86-89.
同类课题研究水平概述
- 极端嗜酸性自养微生物转基因技术是本研究团队利用结合转移技术在国际上率先取得突破的。之后，国际上又有两个研究团队用同样方法成功进行了同类菌的转基因工作，其中之一是本研究室人员出国去欧洲做的工作，另一个是该领域国际知名专家D.E. Rawlings研究室的工作。2010年，我们用比结合转移技术效率更高的电转化技术实现了生物冶金微生物喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）的基因转移[1]，继续保持了极端嗜酸性自养微生物基因转移技术的国际领先地位。在本研究中，我们利用上述技术对喜温硫杆菌进行了遗传改造，促进了该菌的生长代谢。国内除我们团队外，在极端嗜酸性自养微生物转基因技术方面没有其它报道。 混合浸矿菌对矿石的吸附是矿物直接生物氧化机理的前提。但多数研究只研究了混合菌总数变化规律，没有区分混合菌内发挥不同作用的各菌的比例。本研究利用分子生物学方法定量研究了混合吸附各菌的数量，建立了新的吸附模型。 在串联表达金属硫蛋白基因，构建高效、高亲和力重金属生物吸附剂方面，也具有很高的创新性，在环境科学顶级杂志发表并获得了审稿人的好评。 1. Chen L， Lin J，Li B，Lin J，Liu X，2010，Method development for electrotransformation of Acidithiobacillus caldus，J. Microbiol. Biotechnol. 20(1), 39–44.
