基本信息
- 项目名称：
- 用β-半乳糖苷酶制备蔗糖生物传感器核微孔酶膜的方法
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 蔗糖应用广泛，快速准确地测定其含量对微生物代谢研究、植物学研究、食品工业、发酵工业十分重要。 本研究根据戊二醛对半乳糖苷酶特异性和稳定性影响，发现β-半乳糖苷酶在戊二醛作用下活性中心的构型会发生改变，从而酶催化底物由乳糖变为蔗糖，利用这一特性构建出了性能良好的蔗糖酶膜。经测定，其稳定性、响应时间和灵敏度都达到国际最优水平。
- 详细介绍：
- 蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖通过α-1，2糖苷键连接而成的，是可发酵糖，广泛用于发酵工业、食品工业和实验室的微生物培养，快速准确地测定培养液中蔗糖的含量对微生物代谢研究和发酵过程的调控十分重要。在食品工业中需要测定食品成分；监测及控制食品加工生产过程中检验食品质量。另外，蔗糖还是植物学上判断植株光合作用净剩余量的指标，对蔗糖的准确监测，可以有效地预测植物的产量，从而为丰产提供依据。 本研究根据戊二醛对半乳糖苷酶特异性和稳定性影响，发现β-半乳糖苷酶在一定浓度的戊二醛作用下活性中心的构型会发生一定的改变从而由专一分解乳糖的酶分子变为能够专一分解蔗糖的酶分子，并利用这一特性构建出性能良好的蔗糖酶膜，由戊二醛为交联剂，以β-环糊精微球作为固定化材料，核微孔膜为固定载体，改性过的β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、牛血清白蛋白为固定对象。经过实验表明，以下条件：浓度配比为5mg 葡萄糖氧化酶、1ml β-半乳糖苷酶和10mg 牛血清白蛋白溶于1ml蒸馏水中，再以浓度为5%的戊二醛交联一小时，在电极中后熟两天，制得性能最为良好的蔗糖酶膜。 经测定，其稳定性、响应时间和灵敏度都达到国际最优水平。
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 作品设计、发明的目的：常用检测蔗糖方法测定误差较大，易受溶液颜色和浊度的干扰。国标颁布的食品中蔗糖测定方法，虽测定准确精度高，但操作繁琐，费时费力。本课题的目标就是研制出适用于实验室及发酵工业，食品工业快速便捷的准确检测蔗糖的生物传感器。 基本思路：乳糖酶在一定浓度的戊二醛作用下活性中心的构型会发生一定的改变，从而由专一分解乳糖的酶分子变为能够专一分解蔗糖的酶分子，并利用这一特性构建出蔗糖酶膜，由戊二醛为交联剂，以β-环糊精微球作为固定化材料，核微孔膜为固定载体，牛血清白蛋白为活化剂，改性过的半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶为固定对象。 创新点：本发明提供了一种只需要固定化2种酶即可获得蔗糖生物传感器核微孔酶膜的方法，利用β-环糊精作为固定化材料，使用改性过的半乳糖苷酶替代蔗糖转化酶和变旋酶，大大简化酶膜制作工艺，提高酶固定化效果。 关键技术：酶的固定——采用交联法，所用交联剂为戊二醛，固定材料为β-环糊精微球，固定载体为核微孔膜。 主要技术指标：传感器的灵敏度、响应时间、稳定性、使用寿命、线性关系及线性范围等都是衡量其性能的重要指标。经过实验可知，浓度配制为5mg 葡萄糖氧化酶、1mlβ-半乳糖苷酶和10mg 牛血清白蛋白溶于1ml蒸馏水中，再以浓度为5%的戊二醛交联一小时，在电极中后熟两天，制得蔗糖酶膜。反应时间为25s时，线性范围在0.1%-3%，其中在0.2%-1%蔗糖浓度表现良好的线性，其R2达到0.9969，其变异系数在1%以下，使用寿命超过30天。
科学性、先进性
- 科学性：研究发现戊二醛能使β-半乳糖苷酶特异性发生改变，随着戊二醛浓度和作用时间的增加，β-半乳糖苷酶特异性底物便由乳糖变成了蔗糖，利用这一特性，构建出了性能良好的蔗糖酶膜. 蔗糖生物传感器主要是基于葡萄糖传感器构建电流型酶传感器，β-半乳糖苷酶将蔗糖分解成果糖和葡萄糖，葡萄糖再被葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸，同时释放出过氧化氢，过氧化氢与Pt电极接触后便产生电流。电流的大小和样品中蔗糖浓度紧密相关，在一定范围内呈线性相关,从而可以测出蔗糖含量。 先进性：现有蔗糖酶膜的制作都是利用蔗糖转化酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶三酶系构建而成的。本发明方法利用半乳糖苷酶特异性转移的特性制作了葡萄糖氧化酶-半乳糖苷酶双酶系统蔗糖酶膜，能直接通过两步便得到目标信号物质，无论从灵敏度、线性关系还是使用寿命上都具有令人满意的性能。
获奖情况及鉴定结果
- （1）本发明提出了专利申请，国家知识产权局专利局予以受理。 申报号200910067626.3 申报日期2009年1月6日 （2）利用本发明方法制作的蔗糖传感器应用于本团队申请的学校SRT（大学生研究训练）项目《利用蔗糖传感器进行蔗糖通量控制的研究》，作为校级“SRT”计划重点项目并全额发放项目经费。2011年5月递交结项报告。 立项时间2010年7月 项目编号2010072
作品所处阶段
- 实验室阶段
技术转让方式
- 洽谈或者合作
作品可展示的形式
- 图片
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 使用说明：称取β－环糊精溶于由NaOH与戊二醛组成的混合溶液中，加热至晶体分散，发生交联反应形成带有活性醛基的多聚β－环糊精；用蒸馏水洗涤环糊精，晾干后碾磨成均匀颗粒；将颗粒与混合酶液充分混合，25℃下反应80分钟使酶固定化，均匀涂满两张核微孔膜表面。 特点优势、适用范围：现有蔗糖酶膜是三酶系统，本发明制作的酶膜只需固定化两种酶，通过两步便可得结果。适用于需要测定蔗糖含量的领域。如食品工业、发酵工业、微生物代谢研究以及植物学研究。 经济效益预测：生物传感器法是迄今最为快速准确的测糖方法。其优点在于 (1)稳定性好，分析精度高。分析仪采用性质稳定的过氧化氢电极或氧电极，工作性能可靠，配套的固定化酶膜能长期使用，稳定性好。(2)分析成本低。因采用固定化酶膜作为分析工具，昂贵的酶法分析试剂可反复使用数千次，分析成本远低于大型分析仪器。(3)分析速度快，样品用量少。本研究制作的酶膜是双酶系统，通过两步便得到目标信号物质，其灵敏度、线性关系、使用寿命都达到国际水平，利于推广。
同类课题研究水平概述
- 现阶段蔗糖传感器的研究还不是很多，一种是由固定化蔗糖转化酶(INV)，葡萄糖变旋酶(MUT)及葡萄糖氧化酶(GOD)的复合酶膜组成的过氧化氢双电极系统，可同时测定样品中蔗糖和葡萄糖的含量，蔗糖电极的葡萄糖干扰用差分法消除，蔗糖在0-400mg/dl，范围内有线性关系，连续测定20 次蔗糖和葡萄糖的变异系统分别为1.13%和1.05%。蔗糖测定回收率为99.62%-100.97%，半衰期为半个月。但由于酶种类的繁多，使制造工艺相对复杂，且使用寿命较短，故不利于生产推广。 另一种蔗糖含量在线检测装置是由导电针筒与针芯的针形传感器与电路模块连接，电路模块有嵌入式微处理器，其内存储有甘蔗或蔗糖溶液糖含量与脉冲信号作用下产生的电信号关系数据和处理程序。将传感器针刺入甘蔗皮内或浸及溶液，微处理器以50~10kH的电脉冲激励信号检测蔗糖溶液或甘蔗的糖含量。被测物的糖含量不同，电阻率不同，其电压降不同，据此微处理器换算得到糖含量值。可测糖含量为0%~20%，适于田间作业的在线检测。 生物传感器的研制过程也有诸多难点。其一是如何高效地筛分出高活性的酶。为了使传感器具有令人满意的灵敏度，关键是保证有足够量高活性酶尽可能牢固地固定在半导体片上。同时，为了缩短传感器的响应时间及延长寿命，在工艺上将基膜做的尽可能的薄则成为一个难点。生物传感器研制的第三个难点是如何改进传感器对应用条件的适应性与稳定性。为了从根本上解决这些难题，自20世纪90年代以来广泛采用了可溶解正离子复合膜、人工生物材料与分子生物材料等新技术。近年来被学术界公认为最成功的、最具有实用性价值的与食品有关的生物传感器的应用范例有：(1) 形形色色的测量大气中乙醇、硫、胺、二氧化碳、二氧化氮和其他化学成分含量的电子鼻，它在食品与饮料制造业中已大量用于监测有害微生物的污染程度以及各种食品的保鲜程度；(2) 快速分析葡萄糖、谷氨酸、乳酸盐、乳糖、半乳糖等成分的多功能生物传感器； (3) 通过生物传感器测量生物肌体内三磷酸腺苷(ATP) 的变化而实现了鱼肉新鲜度快速测量。
