基本信息
- 项目名称：
- KA1表达再分布对神经元兴奋毒性的影响
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 神经元兴奋性中毒死亡是癫痫发病的重要机制，我们运用海马内立体定位注射KA诱导的小鼠癫痫模型，观察Bederson体征评分变化，运用免疫组织化学方法对比观察。我们的研究提示了海马内KA1表达的变化在神经元兴奋性中毒死亡过程中的重要作用，其可能作为第二信使诱导迟发性神经元兴奋性中毒死亡，为研究以KA1为作用靶点的有效药物提供了有价值的实验依据和理论基础。
- 详细介绍：
- 神经元兴奋性中毒死亡是癫痫发病的重要机制，而兴奋性神经递质和受体在神经元死亡过程中的作用以及特异性的药物作用分子靶点研究是一个重要方向，其中NMDA受体和AMPA受体的研究取得了较大进展, 但关于KA受体的功能和详细的分子机制仍不清楚。我们运用海马内立体定位注射KA诱导的小鼠癫痫模型，观察Bederson体征评分变化，运用免疫组织化学方法对比观察全脑切片中KA受体亚型KA1的表达、表达再分布的变化情况、体视细胞剖面计数法计算死亡神经元数量并进行统计学分析。结果显示，海马内KA注射2小时后，KA1受体在CA1区的表达明显上调, 4小时后CA1区开始出现神经元死亡，6小时可见大量神经元死亡，统计学分析有显著意义。我们的研究提示了海马内KA1表达的变化在神经元兴奋性中毒死亡过程中的重要作用，其可能作为第二信使诱导迟发性神经元兴奋性中毒死亡，为研究以KA1为作用靶点的有效药物提供了有价值的实验依据和理论基础。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：揭示KA1在脑缺血、癫痫等所致神经细胞死亡中的作用及机理；逐步建立相关原创性理论体系。基本思路：针对兴奋性神经递质和受体在神经元死亡过程中所起作用的研究现状，提出KA受体亚型KA1在脑缺血、癫痫等所致神经元死亡的过程中起着一个重要作用的假说，通过运用小鼠模型，结合神经元形态学变化观察进行研究，探索KA1亚受体在神经元兴奋性中毒死亡过程中的作用及可能的临床应用。
科学性、先进性及独特之处
- 摄取了目前国际上对兴奋性神经细胞死亡分子机理研究的新进展，而目前世界上还没有关于KA受体亚单位KA1表达的再分布与神经细胞兴奋性死亡中的关系研究先例，这正是我们这项研究的创新之处，相信我们这项研究将为有效治疗脑缺血、癫痫等,以及药物选择、药品开发、临床应用等方面提供强有力的实验依据和理论基础。
应用价值和现实意义
- 本项研究说明KA的注射导致了海马神经元兴奋性毒性，能填补谷氨酸受体对许多神经退行性疾病变化这一区域的空白，为后续的研究提供参考。
学术论文摘要
- 目的：探究小鼠颅内注射KA之后小鼠海马不同区域KA1再分布状况对中枢神经元兴奋性中毒的影响。方法：成年雄性小鼠海马内注射KA与PBS，2小时后进行Bederson体征评分和脑切片免疫组化检测。结果：Bederson评分的结果证明KA海马内注射后中枢神经元功能的损伤严重；注射KA后，KA1表达的上调主要出现在海马CA1区，导致神经细胞大量死亡。结论：KA促使KA1在海马神经元CA区重新分布，并诱导明显的兴奋毒性,导致神经细胞死亡，中枢神经功能缺失。
获奖情况
- 文章已投递到生物化学与生物物理进展期刊
鉴定结果
- 属实
参考文献
- 1.动物模型制作：海马内注射和切片制作 将小鼠进行麻醉后固定在脑立体定位仪上，使用微量注射器注射药物。麻醉清醒并于注射药物两小时后，对小鼠进行Bederson体征评分，随后灌流，取全脑,后固定，并切片。 2.免疫组织化学方法[1] 将切片置于5%血清和0.3% Triton -100的PBS溶液中反应。将切片置于4℃含一抗的5%血清和0.3% Triton -100的PBS溶液中反应过夜，次日经PBS浸洗后，切片在相应的荧光二抗里孵育2小时,然后检测。 3. FJB染色[2-3] 将固定的脑切片移至载玻片，55℃干燥2小时，使用0.0004% FJB染色20分钟。通过荧光显微镜进行观察。死亡细胞定量计数统计学分析，使用剖面计数法，在油镜下对FJB染色阳性细胞进行计数。通过Student t-test进行统计分析。 4.图像分析 获得的所有图片，均利用BX51/BX52系统，在荧光显微镜下观察、Photoshop (Adobe)处理所得。 文献：1. Chen, Z.-L., J.A. Indyk, T.H. Bugge, K.W. Kombrinck, J.L. Degen, and S. Strickland. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J. Neurosci. ,1999,19:9813–9820. 2.Schmued, L.C., and K.J. Hopkins. Fluoro-Jade B: a high affinity fluorescent marker for the localization of neuronal degeneration. Brain Res,2000,874:123-130 3.Chen, Z.L., J.A. Indyk, and S. Strickland. The hippocampal laminin matrix is dynamic and critical for neuronal survival. Mol. Biol. Cell,2003,14:2665–2676.
同类课题研究水平概述
- 兴奋性氨基酸是广泛存在于哺乳类动物中枢神经系统的正常兴奋性神经递质，参与突触兴奋传递，学习记忆形成以及与多种神经变性疾病有关，例如，中风、缺氧、癫痫等，在这些病理情况下，细胞外谷氨酸浓度的异常增高，过度刺激其受体，对中枢神经系统有明显的毒性作用。而兴奋性中毒是导致这些神经变性疾病中神经元死亡的主要潜在机制。根据谷氨酸配体的特异性可分为三种亚型：NMDA受体、AMPA受体和KA受体。其中NMDA受体和AMPA受体在脑中风所致神经细胞死亡中的作用受到了广泛密切的关注,并就其在脑内分布特点、结构、电生理、作用离子通道等诸多方面展开了深入的研究。AMPA受体广泛分布于大脑皮质、边缘系统、丘脑，是一种跨膜受体，在中枢神经系统中主要介导大多数突触的快速兴奋性突触传递。有研究显示，在动物实验模型中阻断NMDA受体能明显减少脑中风所致神经细胞死亡，但在临床应用的实验中其效果并不明显，其原因是NMDA受体在正常脑功能中起着非常重要的作用，抑制或阻断其功能可使病人意识丧失乃至昏迷，并导致其它非常严重的毒副作用，因此临床应用受到极大的限制。较NMDA受体而言，KA受体有5种亚型分别是KA1，KA2（高亲和力结合位点），GluR5，GluR6，GluR7（低亲和力KA结合位点）。其在正常生理状况下并不像NMDA和AMPA受体分布那样广泛，主要集中分布在以下几个部位：海马区、皮质区、小脑、杏仁核和脊髓，放射配体结合试验表明，在这些表达KA 受体的部位，海马CA3区的含量特别高，并且在不同区域的亚基组成具有较大的差异，KA受体在诸如脑卒中、癫痫发作等病理状况下其表达增加，并可能加重病理变化。正是这些KA 受体亚基在不同区域组成成分的不同，才赋予了不同区域的KA受体独特的性质和特定的功能。海马CA1区较CA3区对缺血损伤敏感是由于其兴奋性氨基酸受体的类型不同，CA1区以NMDA受体为主，CA3区以KA受体为主，而KA受体对缺血敏感性较差，可能是造成迟发性神经元死亡(DND)发生的重要原因。这是目前有关脑中风致神经细胞兴奋性中毒死亡机理研究的一个重要方向。
