基本信息
- 项目名称：
- 草甘膦N-乙酰转移酶基因克隆、表达与酶学性质研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本实验克隆到一个全新的草甘膦N-乙酰转移酶（GAT）基因，能使除草剂草甘膦N乙酰化，使其失去对植物的毒害作用。通过蛋白质工程方法有望大幅度提高该酶活性，使其最终可以应用于转基因作物。
- 详细介绍：
- 草甘膦是世界上应用最广、产量最大的除草剂，是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理。克隆和研究抗草甘膦基因，并将其应用于作物中，能使目标作物不受草甘膦毒害，从而达到除草的目的。 本实验从深海微生物中克隆到一种草甘膦耐受基因，草甘膦N-乙酰转移酶（GAT）基因，能够催化一个转乙酰基的反应，将乙酰辅酶A（AcCoA）上的乙酰基转移至草甘膦的亚氨基上，生成无毒的N乙酰草甘膦，从而解除其毒性。 原始GAT活性较低，结合蛋白质工程手段，对GAT基因进行定向进化，筛选得到高活性的基因将有望使其应用于转基因作物中。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：从深海微生物中分离克隆抗除草剂草甘膦基因，并分析其蛋白质酶学性质，结合计算机辅助设计预测其三维结构，进行定点突变研究其分子机理，为进一步应用于抗草甘膦作物提供理论基础。 基本思路：从深海中筛选抗草甘膦菌株→构建基因组文库→筛选分离抗草甘膦基因→表达纯化蛋白酶→酶学性质分析→计算机辅助设计预测三维结构→定点突变→突变效果分析→分析分子机理
科学性、先进性及独特之处
- 本研究材料来自深海微生物，通过常规的分子克隆技术成功克隆到一个新型的抗除草剂草甘膦基因，利用计算机辅助设计从蛋白质工程水平揭示其分子机理，为其应用转基因作物提供了一定的理论基础。
应用价值和现实意义
- 实际应用中的绝大数农药的主要成分为草甘膦及其衍生物，而且市场上的抗草甘膦作物均为孟山都等国外大型生物公司的产品。该研究旨在得到具有自主知识产权的抗草甘膦基因，并将其应用于水稻、棉花等农作物中。该研究不仅具有巨大的市场价值，而且有望培育出具有自主知识产权的抗草甘膦转基因作物。
学术论文摘要
- 草甘麟是一种广谱灭生性、内吸传导型的除草剂，对人畜低毒，低残留，有很高的商业价值，在全世界范围内得到了广泛使用。草甘磷N-乙酰转移酶(GAT)是一种能够通过转乙酰基的反应将草甘膦代谢为低毒物质-乙酰草甘膦的酶。草甘膦N-乙酰化为作物抗草甘膦提供了不同于EPSPS途径的全新作用机制，它在抗除草剂转基因作物中具有潜在的应用价值。本研究从深海微生物中筛选获得一株产N-乙酰转移酶的细菌Pseudomonas balearica SP1402。通过构建基因组文库，克隆了该新的N-乙酰转移酶基因，并将其克隆在表达载体pGEX -6p-1上组成重组质粒，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达、纯化，进行酶学性质研究，并结合计算机辅助设计和蛋白质工程的方法研究其分子机理。 本研究中的GAT是从含10 mmol/L草甘膦的M9基础培养基上筛得，全长1218bp，编码205个氨基酸，在氨基酸水平上，与Pseudomonas stutzeriA1501同源性最高（92%），与已知可GAT同源性只有4.94%。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- 本研究主要涉及常规的分子克隆技术（包括DNA抽提与酶切、载体制备、酶连、转化）、生物信息学方法（基因预测、Blast比对）、酶学性质分析（蛋白质纯化、酶活测定）、蛋白质工程技术（同源建模、定点突变）等技术。主要参考技术文献： 1.J．萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南（2002年第8版） 2. Daniel L. Siehl.et al. The Molecular Basis of Glyphosate Resistance by an Optimized Microbial Acetyltransferase. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.282,NO.15,pp.11446–11455, April 13, 2007 3. Linda A. Castle.et al. Discovery and Directed Evolution of a Glyphosate Tolerance Gene. Science 304, 1151 (2004)
同类课题研究水平概述
- 目前已发现的抗草甘膦的途径有三种： 一、提高EPSP合成酶的表达量降低草甘膦的抑制作用或克隆对草甘膦不敏感的EPSP合成酶基因。 二、草甘膦降解途径。研究发现，C-N键断裂生成氨甲基磷酸 (AMPA)和C-P键断裂生成肌氨酸是草甘膦降解主要途径。这两种中间代谢物进一步代谢为磷酸、甘氨酸和二氧化碳等，为细菌提供磷源、碳源或氮源。大部分微生物降解中间产物为AMPA，并以共代谢的形式进行，即部分细菌将草甘膦降解为AMPA而另一些则将AMPA彻底降解。 三、草甘膦生物转化途径。2004年Linda A. Castle等人发现一种全新的抗草甘膦基因草甘膦N-乙酰转移酶gat基因，能够催化一个转乙酰基的反应，将草甘膦代谢成低毒物质的乙酰草甘膦，减少除草剂对植物的影响。 目前有关gat基因抗草甘膦的分子机理的报道只有一篇（Daniel L. Siehl等人，2004年），且该gat基因的活性位点已被专利保护。本实验室发现的gat基因与Linda A. Castle发现的gat基因同源性极低，是一个崭新的gat基因，其作用机理、活性位点都有待进一步研究，通过计算机辅助设计和蛋白质工程手段将进一步提高该基因的抗草甘膦活性，有望将其应用于转基因作物中，获得具有自主知识产权的抗草甘膦作物。
