基本信息
- 项目名称：
- 猪pGH基因真核表达载体的构建及其表达
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 猪生长激素生物学效应表现为可促进蛋白质合成和脂肪动用，显著提高猪的生长速度、饲料报酬和降低动物体脂肪含量，因此构建高效表达pGH基因的载体，生产转基因动物可以提高猪的生长速度，降低饲养成本。本试验采用采用的pEGFP-N1载体含有高效的功能强大的启动子SV40 和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达。
- 详细介绍：
- 本研究采取RT-PCR法，得到pGH基因的cDNA序列，然后通过设计引物得到cDS序列，然后运用DNA重组技术将其连接到T载体上，测序完成后酶切，连接到表达载体pEGFP-N1上，得到了可以高效表达pGH基因的载体，并在PK15细胞中表达，本研究在设计引物时，去掉了pGH基因的终止密码子，使得标记基因-荧光蛋白基因和目的基因-pGH基因融合表达，证明了该载体真核表达的可实现性，同时也快捷的验证了pGH基因在细胞内的表达，为下一步的转基因动物的研究奠定了实验基础。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- pGH基因可以显著提高猪的生长速度、饲料报酬和瘦肉率具有明显的经济效益和社会效益。 本实验选择长白猪的pGH基因，并对其进行克隆、测序、连接，得到真核表达载体，并将其转染PK15细胞，得到表达荧光的细胞图片，证明了该真核表达载体的可应用性，旨在为进一步研究节粮型高瘦肉率转基因猪，及其在实际生产中的应用奠定生物学基础。
科学性、先进性及独特之处
- 随着对基因表达调控、蛋白在活细胞中自然状态下变化的深入研究，人们对报告基因或标记基因的要求越来越高。本试验采用采用的pEGFP-N1载体含有高效的功能强大的启动子SV40 和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达。该载体具有易转染真核细胞的特点，且EGFP是一种突变体，能在异源组织中表达并产生荧光，仅需要一定波长的光激发，而且不影响靶蛋白的功能和宿主细胞。
应用价值和现实意义
- 生长激素在动物的生长发育过程中有着重要的生理功能。猪生长激素是单一肽链蛋白质类激素，属于内源激素，但外源GH能显著改善猪生长速度、胴体品质和生长效率，同时减少饲料消耗和猪脂肪沉积。pGH基因可以显著提高猪的生长速度、饲料报酬和瘦肉率具有明显的经济效益和社会效益。
学术论文摘要
- 从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA， 采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 技术，通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上，构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定，并将其转染PK15细胞，通过荧光素酶活性检测特异性表达强度。结果表明，成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体，为转基因猪的研究奠定了基础。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Lebail P Y, Sire M F ,Vemier J M. 1989.Intestinal transfer for growth hormone into the circulatory system of the rainbow trout salmo gaindneri : interference by granule cell [J] . Exp Z ool , 251 (1) :101. [2] Georgopoulou C ,Sire M F ,Vernier J M.1986. Immunological demonstration of intestinal absorption and digestion of protein macromolecules in the trout ( Salno fai- rdneri) [J] . Cell Tissue Rcs ,245 (2) :387. [3] Mclean E ,Donaldson E M ,Dye H M ,et al.1990.Growth acceleration of coho salmon (Onconhynchus hisutch) following oral administration of recombinant bovine sornstotropin [J] . Aquaculture, 91 :197. [4] Franchimont P,Burger H. 1975.Human Growth Hormone and Gonadotripins in Health and Disease. Amsterdam, Elsevier. [5].Alvarez-Dolado,M.,Pardal,R.,Garcia-Verdugo,J.M.,et al.2003.Fusion of bone marrow-derived cells with Purkinje neurons,cardiomyocytes and hepatocytes.Nature 425,968–973.
同类课题研究水平概述
- 猪生长激素基因pGH cDNA ORF编码216个氨基酸残基。猪生长激素基因的原核表达及其抗体制备：将pGH基因亚克隆到原核表达载体pGEX4T-1中，构建了重组原核表达质粒pGEX4T-1／pGH。诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果表明出现与预期一致的1条50.4KDa的特异蛋白新带，重组pGH得到了正确表达。分离包涵体形式表达的融合蛋白GST-pGH，透析得到的重组融合蛋白进行家兔免疫，制备并纯化抗pGH的多克隆抗体；经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法检测，结果证实制备的抗血清对猪生长激素具免疫特异性。Western Blotting检测结果表明：猪天然pGH蛋白和融合表达蛋白GST-pGH能特异性结合该pGH多抗，猪脑垂体组织的免疫组化分析结果也证实了pGH多克隆抗体的特异性。 通过构建表达质粒pPIC-3.5K／pGH，我们研究了猪生长激素基因在酵母细胞中的表达。将猪生长激素(pGH)基因cDNA编码区片断定向插入pMD18-T质粒，转化大肠杆菌JM109，用菌落PCR和质粒PCR方法筛选阳性克隆；以BamH I和EcoRI酶切鉴定重组质粒。将重组质粒用BamH I和EcoR I酶切，胶回收目的酶切片断并定向插入pPIC-3.5K质粒，重组质粒命名为PPIC-3.5K／pGH。该重组质粒经SalI酶切线性化处理后电击转化GS115酵母，采用MD和MM培养基筛选重组子，提取初筛重组子的基因组DNA。PCR方法进一步鉴定，获得的重组酵母菌以甲醇诱导目标蛋白表达，产物经SDS-PAGE和Western-blot分析，复筛得到高效表达pGH的重组酵母，命名为pPIC-3.5K／pGH／GS115。猪生长激素基因在哺乳动物细胞中的表达：将pGH cDNA亚克隆到真核表达载体VR1020上，构建了重组真核表达质粒VpGH；利用脂质体法转染哺乳动物细胞株COS_7，分别于24h、48h、72h提取转染细胞总RNA，对转染后的COS_7细胞进RT-PCR、ELISA和免疫荧光分析。RT-PCR结果显示转染细胞24小时总RNA中已含有目的cDNA片段转录的对应mRNA；ELISA和免疫荧光分析结果表明重组质粒转染后的COS_7细胞中表达了pGH基因的蛋白产物。
