基本信息
- 项目名称：
- 小鼠ISG15基因5′调控区序列的克隆及序列分析
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本文采用LA-PCR 技术扩增小鼠ISG15基因1194bp的5′调控区序列，构建了重组克隆载体pEGFP-N1-ISG15，对阳性克隆进行了PCR扩增、限制性酶切鉴定、DNA测序及生物信息学分析。为进一步确定小鼠ISG15基因核心启动子区域及该基因的表达调控奠定了理论基础。
- 详细介绍：
- ISG15基因作为一种细胞因子，能够激活CD56+自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）的增殖，对小鼠ISG15基因表达调控的研究有利于阐明小鼠的固有免疫及对辛德比斯病毒、流感病毒及人合胞体病毒等疾病的抗性机制，为动物的分子育种及抗病育种工作提供理论依据。本文分别提取3种组织样的DNA并进行扩增，在小鼠脾、肝脏中均扩增出ISG15基因启动子区，而在克隆中发现肌肉组织样中没有扩增出ISG15基因启动子区，其原因可能在于肌肉组织中不含有ISG15基因或含量很少，以至于无法通过PCR克隆。本文成功克隆了长为1194bp的5′调控区，它与GenBank上公布的序列相似性为99.92%。Kerr I M 等通过功能检测方法从干扰素家族的调控序列中找到对ISGs表达具特异增强作用的寡核苷酸片段，得出干扰素家族具有两个必需的小片段：一是GGAAA，存在于SV40增强子核心区；另一是TGAAACT，位于第一小段下游，但ISG15基因不具有该小段。本实验用生物学软件对获得的5′调控区序列进行了相应的生物信息学的分析，证实了这一结论。ISG15基因启动子区ISRE元件中存在必需小片段GGAAA,没有发现小片段TGAAACT，另外启动区没有发现完全一致的NF-kB转录因子结合位点，一个类似结合位点位于-469至-477。此外，我们发现小鼠的ISG15基因5′端非编码区有五处enhancer区和一处ISRE元件，这些区域的小片段可能是ISG15基因启动区域的核心增强子片段，另外该区域也存在着潜在的SP1、H4TF-2、GAS等转录因子结合位点。该区域还发现3处重复元件，这些重复元件可能与保护基因启动子及其它调控元件等“脆弱”部位免受因突变而引起的功能丧失有关，但这些重复元件的具体作用目前还不清楚。本试验成功克隆出长1194bp的ISG15基因 5′调控区片段并对该启动子区运用生物学软件进行了一系列的生物信息学分析，从而对ISG15基因5′调控区获得了更深入的认识。然而，要更深一步研究ISG15基因的表达调控机制，需要利用克隆获得的5′调控区序列构建相关的报告基因载体，然后转染巨噬细胞系，分段对启动子区活性进行表达分析，来确定该基因的核心增强子区及重要的调控元件。
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撰写目的和基本思路
- 为进行ISG15基因5′调控区序列的克隆及序列分析,采用LA-PCR 技术扩增小鼠ISG15基因1194bp的5′调控区序列，构建了重组克隆载体pEGFP-N1-ISG15，对阳性克隆进行了PCR扩增、限制性酶切鉴定、DNA测序及生物信息学分析
科学性、先进性及独特之处
- 试验成功构建了包含小鼠ISG15基因5′调控区的重组质粒；经同源性比对发现ISG15基因5′调控区在不同物种中同源性不高；经过预测该调控区富含GAS、GR、SP1、 NF-1、CBF-B 等转录因子结合位点，有五处Enhancer区、一处ISRE元件以及一处保守的NF-κB结合位点。本研究为进一步确定小鼠ISG15基因核心启动子区域及该基因的表达调控奠定了理论基础。
应用价值和现实意义
- 小鼠ISG15基因的5′调控区的克隆及对其生物信息学的分析，为小鼠ISG15基因的结构和表达调控及其与动物先天性抗病毒、炎症等性状相关性方面的研究提供科学理论依据。
学术论文摘要
- 本文采用LA-PCR 技术扩增小鼠ISG15基因1194bp的5′调控区序列，构建了重组克隆载体pEGFP-N1-ISG15，对阳性克隆进行了PCR扩增、限制性酶切鉴定、DNA测序及生物信息学分析。结果表明：试验成功构建了包含小鼠ISG15基因5′调控区的重组质粒；经同源性比对发现ISG15基因5′调控区在不同物种中同源性不高，在转录起始位点近端的启动子区域中小鼠与人、牛、乌鳢的同源性分别为41.36%，37.89%，38.71%；经过预测该调控区富含GAS、GR、SP1、 NF-1、CBF-B 等转录因子结合位点，有五处Enhancer区、一处ISRE元件以及一处保守的NF-κB结合位点。本研究为进一步确定小鼠ISG15基因核心启动子区域及该基因的表达调控奠定了理论基础。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Pitha-Rowe I F, Pitha P M. 2007,Viral defense, carcinogenesis and ISG15:novel roles for an old ISG[J].Cytokine Growth Factor Rev,18(5-6):409-417. [2] Whitmarsh A J.Filamin B,2009,: a scaffold for interferon signalling[J].EMB0 Rep,10(4):349-351. [3] Der SD et al.1998,Identification of genes differentially regulated by interferon alpha, beta, or gamma using oligonucleotide arrays.Proc Natl Acad Sci USA,95:15623-15628. [4] D’Cunha J et al.1996, Immunoregulatory properties of ISG15, an interferon induced cytokine. Proc Natl Acad Sci USA,93:211-215. [5] Knight E Jr et al.1988, A 15-kDa interferon-induced protein is derived by COOH-terminal processing of a 17-kDa precursor. J Biol Chem,263(10):4520-4522. [6] Yuan W, Krug RM.2001,Influenza B virus NS1 protein inhibits conjugation of the interferon (IFN)-induced ubiquitin-like ISG15 protein.[J]. Embo J. 20(3): 362-371.
同类课题研究水平概述
- 干扰素刺激基因15（ISG15）编码的蛋白是抗病毒天然免疫通路中的重要调节因子,病毒感染和干扰素刺激均可强烈诱导ISG15的表达。ISG15是最早发现的泛素样蛋白,可对细胞内多种蛋白进行修饰并调节蛋白功能,但不介导蛋白质的降解,在机体抗病毒天然免疫反应中发挥重要作用,其机制尚未完全明确。近几年对ISG15的研究有所突破,发现了ISG15在抗病毒天然免疫反应中的新功能。 ISG15 cDNA全长758nt，包含468nt的开放阅读框，编码155个氨基酸，含有两个泛素样（UBL）结构域，C末端具有保守的UB偶联结构（LRGG）.ISG15启动子区存在保守的干扰素刺激反应元件（ISRE）和γ干扰素激活序列（GAS）. ISRE是干扰素刺激基因启动子区的重要特征，并与干扰素调控因子（IRF）1和IRF2的识别序列（IRFE）部分重复；GAS参与介导 II 型干扰素激活基因的诱导转录. 此外，ISG15启动子尚存在TATA，CAAT，Sp1等转录因子结合位点. 乌鳢ISG15基因5′非编码区含有单一的内含子，ISG15 mRNA主要表达在头肾、后肾、脾脏和鳃，肝脏中也有少量表达。体内干扰素诱导剂poly I：C刺激后，ISG15基因在肝脏的表达水平明显增加.
