基本信息
- 项目名称：
- 牦牛血免疫球蛋白IgG提取纯化工艺研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本作品以新鲜牦牛血液为原料，研究低温无水乙醇沉淀法提取IgG的工艺。通过单因素和L16（45）正交试验，优化出最佳工艺条件为：蒸馏水稀释倍数为3倍，乙醇添加量的百分比浓度为25%，pH值为4.5，NaCl溶液的浓度为0.15 mol/L，提取得到的IgG经DEAE cellulose-52柱层析后电泳测定纯度≥95%。
- 详细介绍：
- 本试验将用柠檬酸钠抗凝处理过的新鲜牦牛血4℃离心10min,转速8000r/min，取上清，将待分离样品蒸馏水混合，置冰浴中冷却，在强烈搅拌条件下，加入预冷的无水乙醇，保持在冰浴中，使其产生沉淀，将沉淀悬浮于NaCl溶液中，调pH形成沉淀，取上清，将上清调pH7.4左右，加入预冷的无水乙醇，保持在冰浴中，使其产生沉淀，所得到的沉淀为粗品IgG。将经过预处理的DEAE cellulose-52 装柱，将提取得到的免疫球蛋白G上样、洗脱，紫外监测仪监测洗出液蛋白质含量，采用SDS-PAGE测定蛋白质纯度。本试验用低温无水乙醇沉淀法提取牦牛血免疫球蛋白，综合单因素试验，通过正交试验，得出稀释倍数3倍，乙醇添加量25%，NaCl浓度0.15mol/L，pH4.5是提取的最优工艺条件，其IgG的含量为9.283mg/ml，提取得到的IgG经DEAE cellulose-52柱层析后电泳测定纯度≥95%，经低温冷冻干燥后得到白色固体免疫球蛋白。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 本研究以新鲜的牦牛血液为原料，采用有机溶剂沉淀法从牦牛血红细胞中提取IgG，通过单因素和正交试验确定提取工艺的最佳参数，然后利用凝胶层析和电泳技术对所提取的IgG进行纯化并对其进行测定。通过试验，开发一条可切实可行从牦牛血中提取免疫球蛋白的工艺，从而使屠宰行业产生的大量污染环境的血资源得到充分的利用，给其在终端产品的应用上提供相应的应用依据，使免疫球蛋白产品成为人类健康的保障。
科学性、先进性及独特之处
- 1．以牦牛血液为原料制备免疫球蛋白未见报道，选题具有一定的创新性：目前免疫球蛋白的提取都是从牛奶、蛋黄等及其他动物血液中提取，对牦牛血液中免疫球蛋白的提取利用较少。2．作品没有用传统盐析法而是采用冷乙醇法提取免疫球蛋白IgG，其成本低，速度快，成品安全，结合柱层析法纯化得到高纯度IgG，方法切实可行，为工业化生产提供技术支撑。
应用价值和现实意义
- 本作品针对目前牦牛屠宰后血液大量浪费甚至污染环境的现状，探索可规模化从牦牛血中提取纯化免疫球蛋白IgG的工艺流程和优化工艺参数，为牦牛血的在保健品和食品的应用中提供工艺路线和科学依据，同时也为其它血液功能性蛋白资源的应用提供可借鉴的思路和方法。
学术论文摘要
- 本作品以新鲜牦牛血液为原料，研究低温无水乙醇沉淀法提取IgG的工艺。通过单因素和L16（45）正交试验，优化出最佳工艺条件为：蒸馏水稀释倍数为3倍，乙醇添加量的百分比浓度为25%，pH值为4.5，NaCl溶液的浓度为0.15 mol/L，提取得到的IgG经DEAE cellulose-52柱层析后电泳测定纯度≥95%。
获奖情况
- 暂无
鉴定结果
- 用低温乙醇沉淀提取的IgG经DEAE cellulose-52纯化后纯度较高，与标准品一致。
参考文献
- [1] Friend B. A., Shahani K. M., Mathur B. N., etal. Newer advanced in human milk substitutes for infant feeding[J]. J. Applied Nutr. 1983(35): 88-93. [2] Gin drat J, Gotherfors, L, Hanson. L.A., Win berg J. etal. Antibodies in human milk against E. coli of the serigraphsmostcommonly found in neonatal infections[J]. Acta Paediatr. Scand, 1972(61): 587-591. [3] 金敏摘.口服免疫球蛋白治疗轮状病毒性肠炎[J] .国外医学儿科学分册，1995，22(2): 104-105 [4] 张清玉.口服免疫球蛋白治疗小儿病毒性肠炎60例疗效观察[J] .第二军医大学学报，2004(25): 1241-1242 [5] 郭宪，阎萍等.中国牦牛遗传资源现状分析[J] .中国畜禽种业，2008，(1):60-62
同类课题研究水平概述
- 国内外对免疫球蛋白的分离纯化开展了一定的研究，主要方法是盐析法和有机溶剂法。李敏康提出猪血浆中多种功能蛋白的连续提取工艺，岳喜庆做了有关牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化的试验研究。研究报道主要集中在采用饱和硫酸铵盐析法进行，Barsukov进行了饱和硫酸铵法提取血清中IgG最佳条件的研究，胡晓艳提出饱和硫酸铵法提取IgG工艺的优化，刘生杰将免疫球蛋白G(IgG)三种提取方法进行比较分析。也有学者采用多聚磷酸盐分离有些特殊动物血液中的免疫球蛋白取得显著效果，Kyoung-Sik Han研究了绵阳血免疫球蛋白的分离纯化，罗磊分析了多聚磷酸盐在猪血清IgG分离纯化中的应用，杨严俊进行了猪血免疫球蛋白的分离及功能性研究，庄甜甜提出了全新混合模式吸附层析法在猪血中提取免疫球蛋白。关于乙醇作为有机溶剂分离纯化免疫球蛋白的研究原料主要是蛋黄，尽管有关分离纯化有一定的研究，但是都是简单的一种分离方法探索性研究或者参数优化，没有对IgG从分离纯化、检测方法到功能特性研究系统比较研究，而且是从不同动物血液中进行分离，分离纯化条件之间没有可比性。其实分离方法各有优缺点，饱和硫酸铵法技术成熟，可由于盐添加量较高，虽然后期可以通过透析出去但耗费时间；乙醇分离对温度有严格要求，操作起来有一定的困难，所以选择科学合理的方法对于分离牦牛血免疫球蛋白至关重要。项目组拟采用低温无水乙醇沉淀法分离牦牛血清免疫球蛋白并系统比较研究分离方法，优化分离牦牛血清免疫球蛋白条件。提纯免疫球蛋白的方法很多, 有离子交换法、凝胶过滤法、亲和层析法和超滤法等，其中层析和电泳是快速有效的免疫球蛋白纯化方法，所以本项目选择这两种方法进行研究。 甘肃区域特色畜种牦牛屠宰后存在血液被浪费和污染环境的现状，牦牛血液为原料分离提取IgG尚未见报道，多种方法比较、系统研究IgG分离纯化方法也未见报道，牦牛血液免疫球蛋白提取和应用于食品、保健品方面的尚为空白。项目组依据所处地理位置优势，对牦牛血液综合开发利用已经开展了一定的工作，在牦牛血液血红素、超氧化物岐化酶特别是免疫球蛋白研究方面取得了一定的研究进展。
