基本信息
- 项目名称：
- 以马铃薯淀粉为原料生产燃料用酒精的基因工程酵母菌的研制
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本作品基于对马铃薯块茎芽萌发时可快速降解自身淀粉的能力的观察，借助基因工程技术，分离、克隆了马铃薯α-淀粉酶基因和黑曲霉γ-淀粉酶基因，培育了含上述2个基因的转基因酵母菌，以此提高了马铃薯生淀粉直接进行酒精发酵的效率。有望解决现行酒精发酵工艺中糖化和发酵分别进行、由多个工艺步骤所带来的高能耗和高物耗等问题。使马铃薯这一高产经济作物的价值得以提升。
- 详细介绍：
- 酒精发酵是在无氧条件下，由酵母、真菌、高等植物组织等降解葡萄糖成为以乙醇和二氧化碳为主要产物的代谢过程。据此，环境介质中葡萄糖的有无是酒精发酵能否进行的主要物质条件。虽然马铃薯块茎产量高、淀粉含量也相当高，但因在现行酒精发酵工艺中糖化效率低而不被认为是酒精发酵工业的良好原料。为解决这一问题，我们拟从马铃薯中克隆出编码马铃薯淀粉酶和黑曲霉来源的耐酸耐高温γ-淀粉酶基因，经体外构建后导入酵母菌，培育出可有效降解马铃薯块茎淀粉、并集糖化和发酵等多步骤过程为一步的转基因酵母工程菌。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 马铃薯块茎产量高、淀粉含量也相当高，但因在现行酒精发酵工艺中糖化效率低而不被认为是酒精发酵工业的良好原料。为解决这一问题，我们拟从马铃薯中克隆出编码马铃薯淀粉酶和黑曲霉来源的耐酸耐高温γ-淀粉酶基因，经体外构建后导入酵母菌，培育出可有效降解马铃薯块茎淀粉、并集糖化和发酵等多步骤过程为一步的转基因酵母工程菌。
科学性、先进性及独特之处
- 本作品基于对马铃薯块茎芽萌发时可快速降解自身淀粉的能力的观察，借助基因工程技术，分离、克隆了马铃薯α-淀粉酶基因和黑曲霉γ-淀粉酶基因，培育了含上述2个基因的转基因酵母菌，以此提高了马铃薯生淀粉直接进行酒精发酵的效率。目前尚无同类研究成功的报道。
应用价值和现实意义
- 利用基因操作技术构建的转基因酵母菌株可以稳定地表达α-淀粉酶和黑曲霉γ-淀粉酶，不仅有望解决马铃薯块茎生淀粉用于酒精发酵时效率低下的问题，也将有望解决现行酒精发酵工艺中糖化和发酵分别进行、由多个工艺步骤所带来的高能耗和高物耗等问题。它将不仅使马铃薯这一高产经济作物的工业用途得以扩大、生产与开发价值得以提升，而且将使以马铃薯生淀粉为原料生产的燃料用酒精具有较低成本的市场竞争优势。
学术论文摘要
- 利用RT-PCR方法从马铃薯(S.tuberosum)茎段中克隆了amyA1基因(GQ406048.1)。采用半定量RT-PCR方法检测了amyA1基因在马铃薯茎、叶等不同组织中的表达特异性，表明在茎组织中的表达丰度略高。利用生物信息学软件分析了密码子的偏好性，为选择适宜的表达系统提供依据；同时对蛋白质的理化性质、细胞内的定位、保守结构及高级结构进行了预测.基于NCBI数据库中有代表性物种的29种α淀粉酶构建了基因进化树。结果表明：该基因全长1224bp，编码一条分子量为46.3951kDa的由407个氨基酸残基组成的亲水性胞外蛋白酶类。与NCBI收录的马铃薯α淀粉酶基因（M79328.1）核苷酸及氨基酸序列同源性达98%，在20-348范围内氨基酸含有与淀粉酶13家族及亚家族相似的催化活性域（PF00128、SM00624）、在349-407范围内氨基酸含有α-淀粉酶C-末端β折叠区域（PF07821）。蛋白质的结构预测都表明该基因序列有维持淀粉酶活性的(β/α)8桶状结构以及其他几个功能活性域结构。基因树的构建表明了α淀粉酶基因在不同种属间的进化以及同种间品种差异所引起的酶的差异。
获奖情况
- [1]王永刚,马建忠,马雪青等.马铃薯淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析.食品科学,已录用. [2]王永刚,马雪青,马建忠等.巴斯德毕赤酵母GS115基因组研究进展.食品工业科技,已录用.2010.11 [3] WANG Yong-gang,Wang-Qian,MA Jian-zhong* Tao peng-fei,Su yi.Cloning and Sequence Analysis of Potato α-Amylase Gene. Genomics and Biotechnology,In Pressing 美国国家基因数据库收录基因序列： (1)马铃薯α-淀粉酶基因(amyA1)序列及其编码氨基酸序列(GenBank收录号：GQ406048)，pEamyA1克隆。 (2)马铃薯α-淀粉酶基因(amyA2)序列及其编码氨基酸序列(GenBank收录号：GU134783)，pEamyA2克隆。 (3)黑曲霉γ-淀粉酶基因(amyC1)序列及其编码氨基酸序列(GenBank收录号：HQ537427)，pEamyC克隆。
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1]Park K.H., Kim T.J.,Cheong T.K.,et al,2000,Structure, specificity and function of cyclomaltodextrinase,a multispecific enzyme of the α-amylase family. Biochimica et Biophysica Acta,1478:165-185 [2]Ghang D.M.,Yu L.,Lim M.H,et al, 2007,Efficient one-step starch utilization by industrial strains of Saccharomyces cerevisiae expressing the glucoamylase and α-amylase genes from Debaryomyces occidentalis.Biotechnol Lett,29:1203-1208 [3]Sun L.H,2006,Study on the Relation of the Function and α-Amylase Structure,Thesis for M.S.,HeNan Agricultural University,Supervisor:Chen H.G., pp.3-4 [4]Juge N.,Nøhr J.,Le Gal-Coëffet M.F.,et al.,2006,The activity of barley α-amylase on starch granules is enhanced by fusion of a starch binding domain from Aspergillus niger glucoamylase. Biochimica et Biophysica Acta, 1764:275-284
同类课题研究水平概述
- 乙醇发酵可谓历史悠久，早在公元前2000年，人们就已经掌握了酿酒的技术。除了乙醇作为饮料酒类等嗜好品外，乙醇燃料工业的发展逐渐受到世界各国的重视和青睐。受70年代“石油危机”的影响，许多国家开始关注能源安全。乙醇以其优越大的物理、化学特性不仅是一种优良的燃料，同时作为一种优良的燃油品质改善剂受到重视。巴西、美国等根据本国的实际，实施了燃料乙醇计划。近些年欧共体的国家也纷纷效仿，推行燃料乙醇给国家带来巨大的综合收益：刺激农业生产、维护粮价、完善能源安全体系、减少对石油的依赖、节约外汇、增加就业、增加财政收入、改善燃油品质及大气环境质量等。 我国属于能源短缺的国家，我国政府也已经在十五计划纲要中启动了燃料乙醇计划，而且试点建设了大型燃料乙醇生产装置。在能源短缺和提倡环保的今天，各国政府都十分重视发展可再生清洁能源，燃料乙醇作为可再生清洁能源之一，展示了良好的前景。 乙醇发酵是厌氧发酵过程，酵母细胞在厌氧条件下将可发酵性糖转化为乙醇和CO2。传统的生产工艺一般为游离酵母细胞（Free yeast cells）间歇（Batch）或连续（Continuous）带渣（对淀粉质原料）发酵。目前，乙醇发酵的原料主要是淀粉质原料，如玉米、薯干、木薯等。原料进厂后经清杂净化进入粉碎岗位，粉碎后的粉料按工艺要求的料水比进行调浆，然后经过酶法蒸煮（液化）、糖化、发酵及精馏等工艺步骤，最终得到产品乙醇。 发酵法生产乙醇，是当代世界生物技术产品中数量最大、对人类益处最大的产品。除了满足人类对蒸馏酒和化工产品等需求，在21世纪它还将是人类可再生能源的主要组成部分。据有关专家预测，在21世纪未来的一百年中生物质能源约占总能源组成的20％，其意义是非常重大的。 然而随着世界粮食作物的局限性，各国科学家一方面着手改善传统工艺路线，另一方面着手研究转基因工程菌，利用一些非粮作物进行发酵，生产乙醇的研究，但是都没有获得明显的成绩，因此利用转基因操作技术来改善人类面临枯竭的资源有一定的挑战性和科学性。
