基本信息
- 项目名称：
- C型肉毒梭菌的分离及肉毒毒素的制备、鉴定
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 肉毒梭菌广泛存在于土壤中，对动物尸体旁土壤采用热处理方法，找出对新霉素、卡那霉素、多粘菌素具有抗性的单菌落，染色后镜检选出疑似菌，经生化鉴定确定为C型肉毒梭菌。提取肉毒素后，用蛋白电泳鉴定C型肉毒毒素的重链和轻链的大小分别为98.0KDɑ和53KDɑ，与理论分子量相符。将脱毒后的C型肉毒毒素与弗氏佐剂乳化后免疫家兔，并收集家兔血清。用抗毒素进行琼扩和蛋白印迹实验，检测抗体效价和肉毒素的抗原性。
- 详细介绍：
- 我们从塔里木大学校园内动物尸体旁20-40cm取土壤样品，分别采用热处理、50%酒精处理以及热处理和50%酒精混合处理三种方法对样品进行处理，取200ul的处理样匀浆置于1%葡萄糖疱肉液体培养基中对样品进行富集培养。取富集液倍比稀释，涂平板36℃厌氧培养24h，选出单菌落。将单菌落分别依次涂于新霉素、卡那霉素、多粘菌素平板上，找出对新霉素、卡那霉素、多粘菌素具有抗性的单菌落，经革兰氏染色后镜检选出疑似菌，通过肉毒梭菌对不同糖醇及明胶和七叶苷的分解代谢进行生化鉴定得到C型肉毒梭菌。将鉴定后的C型肉毒梭菌至于pH 7.2-7.4的1%葡萄糖疱肉培养基36℃进行厌氧产毒培养3-5天，用饱和硫酸铵分离毒素。将分离的毒素置于透析袋中纯化并浓缩肉毒毒素，采用SDS-PAGE电泳鉴定C型肉毒毒素的重链和轻链的大小分别为为98.0KDɑ和53.2KDɑ，与理论分子量相符。用65℃ 30min将C型肉毒毒素进行脱毒处理，将脱毒后的C型肉毒毒素与弗氏佐剂乳化后制成免疫佐剂，对家兔进行免疫，免疫结束后收集家兔血清。用抗毒素进行琼脂扩散实验和Western blotting实验，检测抗体效价和肉毒素的抗原性。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 肉毒毒素是一种强烈的神经毒素。根据抗原性不同，分为A~G型。C型肉毒素是种高分子蛋白质毒素，两个亚单位由二硫键连接成双链分子。为确切了解和评价C型肉毒素的特点，我们分离鉴定C型肉毒梭菌和肉毒毒素，为进一步的应用奠定基础，也为其他研究者提供理论依据，有助于深入研究肉毒梭菌及毒素。先分离鉴定C型肉毒梭菌；再提取纯化C型肉毒毒素；最后制备C型肉毒毒素的抗毒素。研究C型肉毒素的抗原性，为后续研究奠定基础。
科学性、先进性及独特之处
- 实验设计合理，立项依据充分，实验方法正确，结论真实可信，结果可为研究者提供参考。随着各型肉毒毒素的生物特性、药理作用方面研究的不断深入，肉毒毒素将得到更广泛的应用。通过对肉毒素修饰改造，使毒素应用范围更加扩大，应用研究有良好的前景，相信将来对毒素研究与应用会有更大的突破性进展。此外，对于A型肉毒毒素的研究非常透彻，而对于C型肉毒素研究较少，因而我们开展了此项研究，为深入研究C型肉毒素提供理论依据。
应用价值和现实意义
- 肉毒毒素微量就可致病甚至致死。现如今人们生活中越来越多的食用豆制品以及火腿等食物，在包装、卫生等条件不达标的情况下非常容易导致食物中产生肉毒梭菌及肉毒毒素，对人们的生活有极大的影响。研究C型肉毒梭菌肉毒素，可以用来制备生物毒素防治虫鼠害，生物抗衰老作用的发现也成为另一个重要原因，同时对肉毒素及抗毒素的制备，可以紧急治疗肉毒中毒，也可用于检测食品中的肉毒素，为食品的安全提供一定的保障。
学术论文摘要
- 肉毒梭状芽孢杆菌广泛的存在于土壤、发酵食物、肉类罐头食品中。采集动物尸体旁土壤、水产市场排水道土壤，通过对土壤分别采用热处理、50%酒精处理及热处理和50%酒精混合处理三种方法进行分离肉毒梭菌，最终在动物尸体旁土壤中分离到抗逆细菌。通过比对三种处理方法，得出用50%酒精的处理方法的处理效果最好。通过肉毒梭菌对新霉素、卡那霉素、多粘菌素具有抗性这一特性对已分离的细菌进行选择培养进一步分选，找出对这三种抗生素具有抗性的单菌落。革兰氏染色镜检选出疑似菌，经生化鉴定确定为C型肉毒梭菌。肉毒毒素是肉毒梭菌产生的一种神经毒素，能够通过抑制神经肌肉接头处的乙酰胆碱释放而引起肌肉麻痹。肉毒毒素在培养液中以复合物形式存在，其中的毒性组分由3个非同源性结构域组成，是一种新型的金属蛋白酶。不同血清型的肉毒毒素能够特异性地作用于不同底物，这些底物在神经细胞的胞外分泌过程中发挥重要作用。对提取的C型肉毒梭菌产生的肉毒素进行灭活处理后通过SDS-PAGE进行浓度测定，确定浓度后给家兔进行免疫，免疫结束后心脏采血分离血清。用抗毒素进行琼脂扩散实验和Western blotting实验，检测抗体效价和肉毒素的抗原性。
获奖情况
- 1、获得“塔里木大学动物科学学院第二届学术交流会优秀论文三等奖”； 2、在2010年中国微生物学会学术年会上发表论文《肉毒梭菌的研究现状及应用》
鉴定结果
- 分离出C型肉毒梭菌，掌握C型肉毒梭菌培养条件并提取肉毒素，用蛋白印迹技术鉴定出肉毒素重、轻链大小约为98KDɑ和53KDɑ。用琼扩检测抗体效价为1:8，蛋白印迹技术检测肉毒素抗原性。
参考文献
- [1] 刘爱萍.肉毒梭菌的控制[M].肉类研究,2007,10(104):37-39. [2] 王想霞,杜俊甫,麻顺广等.濮阳市肉毒梭菌生态分布的研究[J].中国公共卫生,2000,16(3):282-286. [3] 江扬,熊晓晖等.肉毒梭菌的筛选及菌株的鉴定[D].南京:工业大学,2003,14-15. [4] 高建军,张超,赵红等.C型肉毒毒素的制备及类毒素保护力初探[J].微生物学免疫学进展,2008,36(1):19-23. [5] (美)J.萨姆布鲁克.E.F.弗里奇.T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁.黎孟枫等译.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版,1992.8:634-654，854. [6] 朱平,冯书章主编.抗体制备技术[M].第一版.长春:长春出版社,1994.102-115. [7]王世若,王兴龙,韩文瑜主编.现代动物免疫学[M].吉林:科学出版社,2001,183-195. [8] Prager W, Wimüller E, Kollhorst B,et al. Treatment of crow's feet with two different botulinum toxin type : A preparations in split-face technique[J].Hautarzt,2011,62(5):375-379. [9] 朱力,王恒樑,黄留玉.肉毒毒素研究进展[J].生物技术通讯,2005, 16(7)186-190. [10] Horowitz BZ. Type E botulism[J].Clinical Toxicology,2010,48(9):880-895.
同类课题研究水平概述
- 肉毒梭菌是一种腐物寄生菌。肉毒梭菌在自然界分布广泛，土壤中常可检出，江、河、湖、海沉积物，水果，蔬菜，畜、禽、鱼等制品中亦可发现， 霉干草和畜禽粪便中均存在。早在18世纪末以前，在欧洲，尤其是在德国就已被人们所认识，由于那时候引起中毒的食品主要是腊肠，所以这种中毒就取自腊肠的拉丁文Botulus，而称为腊肠中毒。在我国过去的一些书中，把本病译为腊肠中毒，把肉毒梭菌译为腊肠(毒)杆菌或腊肠(毒)梭菌。引起肉毒中毒主要是食入含有肉毒毒素的食品。这些食品是在调制加工、运输贮存的过程中，污染了肉毒梭菌芽胞，在适宜条件下，发芽、增殖并产生毒素所造成的。在国外，引起肉毒中毒的食品多为肉类及各种鱼、肉制品、火腿，以及豆类、蔬菜和水果罐头。中毒食品种类往往与饮食习惯有关：欧洲各国主要的中毒食品为火腿，腊肠和其他肉类等。美国主要是家庭制的水果罐头，而火腿、腊肠等加工食品仅占7．7％。苏联和日本鱼制品中毒最多，尤其是日本，几乎全是鱼制品的E型中毒。我国也有肉毒中毒的报导，肉类食品及罐头食品引起的中毒的较少，据新疆肉毒科研协作组的223起肉毒中毒的调查统计，臭豆腐、豆鼓、面酱、红豆腐、烂土豆等植物性食品共204起，占91．48％；其余的19起(占8．52％)是动物性食品，包括熟羊肉、羊油、猪油、臭鸡蛋、臭鱼、咸鱼，腊肉、干牛肉、马肉等。目前已知肉毒梭菌有A、B、C、D、E、F、G等7个菌型。引起人中毒的主要是A、B、E三型，C、D型主要是畜禽肉毒中毒的病原，F型只见报导发生在个别地区，如丹麦和美国各一起。1980年从瑞士五名突然死亡病例中发现G型毒素。肉毒梭菌产生的是一种神经毒素，是目前已知的化学毒物与生物毒素中毒性最强烈的一种，对人的致死量为9-10mg／Kg，其毒力比氰化钾还大一万倍。肉毒梭菌在自然界的分布上具有区域性差异。A、B型的分布最广，其广泛分布于自然界，各大洲的许多国家均有检出，研究较多；C、D型一般多存在于动物的尸体中或腐尸附近的土壤中，研究较少；E型多存在于海洋的沉积物、水产品的肠道内；F型适应于深水的低温。越来越多的调查结果表明，除G型菌之外，其它各型菌的分布都是相当广泛的。为了确切了解和评价C型肉毒素的特点，研究C型肉毒梭菌产生的肉毒素，可以用来制备生物毒素防治虫、鼠害，同时抗毒素的研制，可以紧急治疗人类因误食含有肉毒素的食物而中毒，为食品的安全提供一定的保障。
