基本信息
- 项目名称：
- 一株虎杖糖苷水解酶产生菌的筛选、鉴定及其酶学特性的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 采用滤纸荧光斑点-薄层层析法同步测定，从浏阳河附近土壤中分离获得一株虎杖糖苷水解酶活力高的棘孢曲霉Lysgpj-10。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳电洗脱二步循环法分离纯化，该酶为β-葡萄糖苷酶，为单体蛋白，分子量为27.3kDa，等电点为4.65。该酶水解虎杖苷的最适pH为5.0，最适温度为55℃，在此条件下虎杖糖苷水解酶的米氏常数Km为5 mg/mL虎杖苷，白藜芦醇转化率达98.5%。
- 详细介绍：
- 生物转化与催化是生物技术革命的第三个浪潮，目前生物转化法制备白藜芦醇是国内外研究的热点。本作品采用滤纸荧光斑点-薄层层析法同步测定，从浏阳河附近土壤中分离获得一株虎杖糖苷水解酶活力高的菌株Lysgpj-10。经形态学和分子生物学鉴定，确定该菌为棘孢曲霉（Aspergillus.aculeatus CGMCC No.3876）。粗酶液经Amicon XM-50超滤浓缩、聚丙烯酰胺凝胶电泳电洗脱二步循环法分离纯化，该酶为β-葡萄糖苷酶，为单体蛋白，分子量为27.3kDa，等电点为4.65。酶学特性研究表明，该酶水解虎杖苷的最适pH为5.0，最适温度为55℃，在此条件下虎杖糖苷水解酶的米氏常数Km为5 mg/mL虎杖苷，白藜芦醇转化率达98.5%。制备虎杖糖苷水解酶及其复合酶制剂，开发具有自主知识产权的制备高纯度白藜芦醇的工艺路线，并用于指导类似天然产物的开发，将促进我国生物转化与催化领域的发展。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：提供一项虎杖糖苷水解酶产生菌的筛菌方案及该酶的分离纯化方案。 基本思路： 1、采用滤纸荧光斑点-薄层层析法相组合的筛菌方案； 2、发酵产酶条件优化和菌种鉴定，虎杖糖苷水解酶转化PD生成产物的HPLC鉴定； 3、虎杖糖苷水解酶的分离纯化及其酶学特性研究，SDS-PAGE和IEF测定虎杖糖苷水解酶的分子量和等电点。
科学性、先进性及独特之处
- 1、PD的糖苷键是β-构型，β-葡萄糖苷酶能切断其糖苷键生成Res，因此可通过产β-葡萄糖苷酶的微生物转化PD生成Res。 2、采用应用较为广泛的虎杖微生物发酵法。 3、①采用滤纸荧光斑点-薄层层析同步测定的方法筛选高效菌株；②采用Amicon XM-50、聚丙烯酰胺凝胶电泳电洗脱二步循环法分离纯化虎杖糖苷水解酶；③虎杖糖苷水解酶酶活力高。米氏常数Km为5 mg/mL虎杖苷。
应用价值和现实意义
- 菌株Lysgpj-10发酵制备的复合酶能从虎杖材料中高效提取PD及其类似物，提取率为2.3%，未加所述复合酶（对照）同等条件下的提取率仅为1.2%，处理提高了91.7%。用所述复合酶将PD转化为Res，转化率达99.5%以上。用分离纯化得到的虎杖糖苷水解酶将PD（浓度1.5%）转化为Res，转化率达99.7%，提取的Res纯度达98.5%。
学术论文摘要
- 采用滤纸荧光斑点-薄层层析法同步测定，从浏阳河附近土壤中分离获得一株虎杖糖苷水解酶活力高的菌株Lysgpj-10。经分子生物学测定18s rDNA和5.8s rDNA之间ITS保守序列，构建进化树以及形态学鉴定，确定该菌为棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus Lysgpj-10 (CGMCC No.3876)）。粗酶液经Amicon XM-50超滤浓缩、聚丙烯酰胺凝胶电泳电洗脱二步循环法分离纯化，该酶为β-葡萄糖苷酶，为单体蛋白，分子量为27.3 kDa，等电点为4.65。酶学特性研究表明，该酶水解虎杖甙的最适pH为5.0，最适温度为55℃，在此条件下虎杖糖苷水解酶的米氏常数Km为5 mg/mL虎杖苷，白藜芦醇转化率达98.5%。
获奖情况
- 2011年5月荣获我校大学生学术科技作品竞赛二等奖。 2011年5月荣获我省大学生课外学术科技作品竞赛二等奖。
鉴定结果
- 无
参考文献
- 1、薄层层析-紫外分光光度法测定酶解液中Res和PD的含量 [1] 刘新荣, 高丽萍, 夏涛, 邹伟伟, 陈恩昊. 薄层层析-紫外分光光度法测定葡萄果皮中白藜芦醇及白藜芦醇苷[J]. 生物学杂志, 2008, 25（5）. 2、薄层扫描仪测定薄板上荧光斑点的Res或PD的含量 [1] 舒友琴, 陈敏, 杨喜花, 王巍. 薄层荧光扫描法测定虎杖中的白藜芦醇和白藜芦醇苷[J]. 药物分析杂志, 2006, 26（9）: 1334-1336. 3、聚丙烯酰胺凝胶电泳电洗脱二步循环法分离纯化β-葡萄糖苷酶 [1] Yuanshan Lin, Guiguang Chen, Min Ling, Zhiqun Liang. A method of purification，identification and characterization of β-glucosidase from Trichoderma koningii AS3.277[J]. Journal of Microbiological Methods, 2010, 83: 74－81. 4、β-葡萄糖苷酶转化PD生成产物的HPLC鉴定 [1] 田天丽, 沈竞, 徐萌萌, 王敬, 孙启玲. 虎杖中虎杖苷的微生物发酵转化研究[J].四川大学学报, 2008, 45（2）: 438-440.
同类课题研究水平概述
- 1、袁润蕾的论文（时珍国医国药，2008）利用一株根霉菌株T34对10%虎杖苷粗提物进行液态发酵，使虎杖苷转化成白藜芦醇，采用薄层色谱法确定在优化发酵条件下转化时间为26. 8 h，通过高效液相色谱法证明虎杖苷转化为白藜芦醇，转化率达95.8%。 2、田天丽的论文（四川大学学报，2008）从中药材虎杖中筛选到一株具有转化虎杖苷能力的根霉菌株T234，利用该菌株产生的β-葡萄糖苷酶能将虎杖苷转化为白藜芦醇，转化率达98%。
