基本信息
- 项目名称：
- 高产青霉菌株BM16-3的纤维素酶特性的鉴定及纤维二糖水解酶基因的克隆
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本作品通过以微晶纤维素(Avicel)为唯一碳源，从自然环境分离筛选到具有微晶纤维素(Avicel)降解能力的青霉，通过对其所产纤维素酶特性的研究，从中获得产高酶活力纤维素酶的青霉，同时对纤维二糖水解酶基因进行克隆，为提高纤维素的降解效率，获得高比活力的纤维素酶奠定基础，为下一步分子改造提供材料，为进一步提高纤维素酶比活力提供参考，从而为研发以纤维素为原料生产燃料乙醇用纤维素酶提供基因资源。
- 详细介绍：
- 从采自山口红树林、白马雪山、东北的原始森林土壤中分离筛选到47株青霉，用Avicel作为唯一碳源、pH5.0的培养基平板在28℃培养72h后分离得到单菌落，经刚果红染色后，通过比较透明圈的透明程度和大小初步筛选出能够降解结晶纤维素的青霉菌株。再用Avicel作为唯一碳源的液体培养基摇瓶培养初筛所得的菌株，诱导产酶后，取上清液，用DNS法测定菌株所产生的纤维素酶粗酶液水解Avicel底物的最适pH及最适温度以及最高酶活力。 发现青霉菌株SK9-1, DB1-2, BM16-3, BM1-2的酶活相对较高，分别达到0.302 IU/mL， 0.295 IU/mL， 0.323 IU/mL， 0.282 IU/mL，该四株青霉菌株纤维素酶的最适作用温度分别为55℃，45℃，50℃，40-45℃，最适作用pH值分别为4.5，4.5-5.0，5.0，5.0。BM16-3在其产酶的最适条件下，酶活最高，选作进一步研究。通过对青霉菌株BM16-3产纤维素酶水解Avicel产物的TLC分析，发现BM16-3纤维素酶作用Avicel所产葡萄糖量随作用时间延长而增多，24 h后产生大量葡萄糖和微量纤维二糖。推测BM16-3纤维素酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶，具有完整的纤维素酶系统。结合真菌形态学观察及内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列同源性比对结果，将菌株BM16-3初步鉴定为草酸青霉(Penicillium oxalicum)。 用PCR的方法，根据已知同源纤维素酶的基因序列设计引物克隆了菌株BM16-3的纤维二糖水解酶基因cbh1，经分析该基因序列的长度为1614 bp，编码537个氨基酸，与已发表的草酸青霉F67（GeneBank登录号：EU727171）纤维二糖水解酶Ⅰ基因序列同源性为98.1%。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：本实验以高产青霉菌株为材料，为提高纤维素的降解效率，获得高比活力的纤维素酶奠定基础，为下一步分子改造提供材料，为进一步提高纤维素酶比活力提供参考，从而为研发以纤维素为原料生产燃料乙醇用纤维素酶提供基因资源。 基本思路：通过对已分离筛选出的多株青霉菌株进行形态观察等多种菌种鉴定方法及纤维素酶学特性的鉴定，筛选出最有应用潜力的菌株进行纤维二糖水解酶基因的克隆，并对该基因进行分析。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：本实验的技术路线是青霉菌株的筛选；产酶特性分析；酶活力高，特性好青霉菌株的鉴定；克隆并分析纤维素酶基因。 先进性：相对于木霉菌，目前对青霉的纤维素酶基因研究相对较少，获得的基因将用于纤维素酶分子的改造，对于丰富微生物降解纤维素的认识具有重要作用。 独特之处：本工作对青霉菌产生纤维素酶的研究发现该酶系降解纤维素产生较多的葡萄糖而不是纤维二糖，这种完善的纤维素酶酶系具有很高的研究价值。
应用价值和现实意义
- 实际应用价值：通过青霉菌株的筛选及鉴定工作，得到了酶活力高达0.323 IU/mL，最适pH值5.0、最适温度50℃的青霉菌株，同时克隆得到纤维二糖水解酶基因，为进一步进行菌种改造和纤维素酶基因的人工改造提供材料，进而满足工业应用的要求。 现实意义：本作品从分离筛选到青霉菌株中的酶活力高、酶学性质好青霉菌株，并从中克隆鉴定纤维素酶基因，为研发以纤维素为原料生产燃料乙醇用纤维素酶提供基因资源。
学术论文摘要
- 从采自山口红树林、白马雪山、东北的样品中分离筛选到47株青霉，用Avicel作为唯一碳源，pH5.0的培养基在28℃培养72h分离得到单菌落，经刚果红染色后通过透明圈的透明程度和大小初步筛选出能够降解结晶纤维素的青霉菌株。再用Avicel作为唯一碳源的液体培养基摇瓶培养初筛所得的菌株，诱导产酶后，取上清液对CMC及Avicel底物用DNS法测定菌株的所产生的纤维素酶粗酶的最适pH及最适温度以及最高酶活力，再根据用同步糖化共发酵工艺生产乙醇对纤维素酶特性的要求，综合评比出最合适、有继续研究价值的菌株，并对其进行分类鉴定。再采用RT-PCR的方法，根据已知同源纤维素酶的基因序列设计引物克隆其纤维二糖水解酶基因，并对该基因进行分析。 关键词 青霉 纤维素酶 RT-PCR 克隆
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Zhang Y-HP, Himmel ME, Mielenz JR (2006) Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies. Biotechnol Advan 24:452-481 [2] Teeri TT (1997) Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolase. Trends Biotechnol 15(5): 160-167 [3] Lynd LR, Weimer PJ, Willem HZ, et al. (2002) Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiol Mol Biol Rev 66:506-577 [4] Henrissat B (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J 280: 309-316 [5] Hong J, Tamaki H, Yamamoto K, et al. Cloning of a gene encoding thermostable cellobiohydrolase from Thermoascus aurantiacus and its expression in yeast[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 63 (1): 42-50 [6] Juhasz T, Kozma K, Szengyel Z, et al. Production of β-glucosidase in mixed culture of Aspergillus niger BKMF 1305 and Trichoderma reesei RUTC30[J]. Food Technol Biotechnol, 2003, 41 (1): 49-53
同类课题研究水平概述
- 由于能源的短缺问题刺激了各国研究生物质能源，使得燃料乙醇研究迅猛发展，其中以美国和巴西的研究最有代表性。 我们知道直接用谷物，甘蔗等作物生产燃料乙醇的技术十分成熟和便利，但是也存在巨大的缺陷——与人畜争夺粮食。对于我国这样一个人口众多，土地资源短缺，粮食是极其重要的战略资源的国家来说，单纯靠粮食淀粉发酵生产乙醇是不现实的。 因此，利用非粮作物发酵生产燃料乙醇应该是我国的重点。我国的纤维素资源极其丰富，农作物秸秆的年产量列世界之首；每年生产的工业纤维素废渣数千万吨；适合于种植林草的荒地、荒山面积巨大等等都可以专门用作能源作物的生产，这些对于发展以非粮作物为原料的燃料乙醇极为有利。 植物纤维素为原料生产燃料乙醇主要有两条途径——热裂解和生物转化。纤维素生产燃料乙醇目前最先进最有效的方法是酶法发酵，但是同样面临很多问题：（1）原料分布分散、收集成本高（2）天然纤维素原料的结构性质非常复杂，纤维素的高度结晶性和木质化，阻碍了酶与纤维素的接触，使其难以被生物降解。所以，为提高酶解效率必须进行适当的预处理。（3）目前用于纤维素酶发酵生产的纤维素酶比活力普遍较低、成本较高，这也妨碍了木质纤维素资源酶法生物技术转化的实用化。（4）总量占植物纤维素10-40％的半纤维素水解产物含有大量的五碳糖，而这些戊糖一般不能被通常的酿酒酵母发酵为乙醇，这也会使乙醇的得率大大降低。 在酶法发酵过程中，不溶于水且纤维素酶不易接近的纤维素原料需要经过预处理后再用纤维素酶等酶解糖化共发酵，然后用酵母发酵工艺生产乙醇，产物经分离纯化后即获得成品燃料乙醇。利用纤维素资源生产燃料乙醇的生产过程中最为关键，也是反应限速步骤的纤维素水解过程要靠纤维素酶来完成。 因此，纤维素酶的研究在以纤维素为原料的燃料乙醇的生产过程中具有重要的意义。 对于纤维素原料生产燃料乙醇来说，纤维素酶特别是内、外切葡聚糖酶的水解效率是降低生产成本、影响燃料乙醇推广的关键因素。在自然界中纤维素酶主要是在细菌、真菌以及食草动物的瘤胃中，本项目是从筛选得到的酶活力高、酶学性质好的青霉菌中克隆鉴定纤维素酶基因，为研发以纤维素为原料生产燃料乙醇提供基因资源。
