基本信息
- 项目名称：
- 中华鳖群体死亡症二价基因工程缓释疫苗的研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本研究构建了融合质粒pET-ompA-hly，转化受体菌BL21（DE3），获得了阳性重组菌株BL21（DE3）（pET-ompA-hly）。诱导阳性重组菌株目的基因表达，制备二价基因工程疫苗。将表达的目的蛋白与PLGA材料混合乳化，制备微球。通过优化制备条件，检测包封率和体外释放时间，进行动物免疫实验，检测二价基因工程缓释疫苗的保护率及其体内释放效果。为制备中华鳖群体死亡症基因工程疫苗奠定基础。
- 详细介绍：
- 中华鳖是我国淡水养殖名优品种之一，具有良好的营养价值、经济价值和药用价值。但近几年来，特种水产养殖尤其是养鳖业迅猛发展，高密度人工养鳖业中鳖病肆虐发生, 如红脖子病、红底板病、白底板病、穿孔病、疥疮病等。2008年4月在石家庄地区暴发了中华鳖群体死亡，鳖体没有明显病症，病死鳖经解剖观察可见其肝肿大，呈土黄色，有出血点。但其致死原因不明，而且死亡率很高，给养殖户造成了严重的经济损失。 经大量报道表明，中华鳖常见的传染性疾病多由气单胞菌属的病原菌导致。嗜水气单胞菌是在同一水体环境中的水生生物中分离出的最常见的病原菌之一，维氏气单胞菌是于2007年由本实验室从发生群体死亡的病鳖体内分离鉴定出来的致病菌。两者的主要致病因子包括外膜蛋白、S层蛋白、内毒素、外毒素、胞外酶、铁转运蛋白等。外膜蛋白等生物被膜结构可使病原菌吸附于宿主细胞，从而激发机体的细胞免疫和体液免疫应答，具有良好的免疫原性。外毒素可造成宿主细胞不同毒性而致病，并且已有报道证实外毒素中的溶血素具有三种毒性，这在免疫学上具有重要意义。因此，这两种蛋白可做为候选抗原。本实验扩增维氏气单胞菌的外膜蛋白ompA基因及嗜水气单胞菌的hly毒素基因，构建融合质粒并进行表达，制备基因工程二价疫苗并研究其免疫原性。本研究根据GenBank报道的维氏气单胞菌ompA基因序列和嗜水气单胞菌hly基因序列，分别设计了两对引物，PCR扩增得到ompA和hly基因。将ompA和hly两个基因融合后与PET-28a连接，得到重组质粒pET-ompA-hly，转化受体菌BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3) (pET-ompA-hly)，通过SDS-PAGE和Western blot分析ompA-hly融合蛋白的表达情况，采用生物可降解高分子材料PLGA，通过W/O/W法制备口服缓释微球，并对制备工艺进行初步优化。采用微球对基因工程菌株BL21(DE3)(pET-omp-hly)包封后进行动物保护性实验。结果表明：PCR扩增得到了ompA和hly基因，序列分析结果表明，ompA和hly基因片段大小分别为1000bp和1500bp，与参考序列同源性分别为97.45%和96.58%。重组蛋白得到了高效表达，ompA-hly融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 26.3%，Western blot分析表明表达的目的蛋白为特异性产物。微球制备得到包封率为68.8%，外观较好的微球。免疫动物实验结果表明基因工程菌株具有较好的免疫保护效果保护率高达100%，抗体效价为1：1600。经微球口服免疫的保护率高达95%，抗体水平较高并且免疫期较长，二免后40d抗体依然呈阳性。本研究成功制备了ompA-hly二价基因工程缓释候选疫苗，口服使用安全，具有较高的抗体水平及较长的免疫期。为预防中华鳖群体死亡症找到一种安全、快捷、有效的免疫预防途径。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 撰写目的：本实验结合基因工程疫苗和缓释制剂制备成二价基因工程缓释疫苗，采用口服免疫的方法使实验动物获得免疫，旨在找到一种安全、有效、便捷的防治中华鳖群体死亡症的途径。 基本思路：1、构建融合质粒pET-ompA-hly，转化受体菌BL2进行诱导表达和条件优化并检测。 2、制备二价基因工程疫苗，进行动物保护性实验，测免疫原性 。 3、制备微球，优化制备条件。检测包封率、体外释放时间及保护结果。
科学性、先进性及独特之处
- 1、进行二价基因工程疫苗的研究，使制备的疫苗能同时防治两种致病菌，即维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌。 2、使用PLGA作为包封材料，可使药物按一定规律缓释，使药物在体内较长时间能保持有效药物浓度，达到减少药物总剂量，提高药效，延长作用时间和减少副反应的目的。 3、研究检测口服微球缓释二价基因工程疫苗的免疫保护率、效价和保护期。为预防中华鳖群体死亡症找到一种安全、快捷、有效的免疫预防途径。
应用价值和现实意义
- 将引发疾病的两种病原菌分别提取保护性抗原基因，并连接在同一个表达载体上，制备二价基因工程疫苗，使制得的一支疫苗可以同时防治两种病原菌的感染。口服药剂使用便捷、安全，毒副作用小。用生物降解高分子材料制备包封率高、载药率高和制剂稳定性较高的生物药剂正成为药物研究的主流方向。免疫疫苗口服剂型的研制成功, 将是防治鳖类疾病研究的一次重大突破,为鳖类疾病预防提供新的途径，具有重要的理论价值和应用前景。
学术论文摘要
- 将ompA和hly两个基因融合后与PET-28a连接，得到重组质粒pET-ompA-hly，转化受体菌BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3) (pET-ompA-hly)，通过SDS-PAGE和Western blot分析ompA-hly融合蛋白的表达情况，采用生物可降解高分子材料PLGA，通过W/O/W法制备口服缓释微球，并对制备工艺进行初步优化。采用微球对基因工程菌株BL21(DE3)(pET-omp-hly)包封后进行动物保护性实验。结果表明：重组蛋白得到了高效表达，ompA-hly融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 26.3%，Western blot分析表明表达的目的蛋白为特异性产物。微球制备得到包封率为68.8%，外观较好的微球。免疫动物实验结果表明基因工程菌株具有较好的免疫保护效果保护率高达100%，抗体效价为1：1600。经微球口服免疫的保护率高达95%，抗体水平较高并且免疫期较长，二免后40d抗体依然呈阳性。本研究成功制备了ompA-hly二价基因工程缓释候选疫苗，口服使用安全，具有较高的抗体水平及较长的免疫期。
获奖情况
- 2011年校级科技创新竞赛 特等奖 2011年省挑战杯大学生课外学生科技作品竞赛一等奖 本研究的相关内容被《XX学报》接收，将在2011年7月发表于在2011年第4期上（见附件）。
鉴定结果
- pET-ompA-hly融合质粒表达及基因工程二价菌株构建组织切片验证电镜微球呈规则圆球状，表面较光滑体外释放结果显示，微球体外释放可持续30天动物免疫保护性实验结果表明保护率较高
参考文献
- [1]钱明明,赵宝华等.中华鳖常见疾病的诊断及其综合防治[J].动物医学进展,2009,30(4):103-107. [2] Reyes-Sandoval A, Ertl HC. DNA vaccines[J]. Curr Mol Med, 2001, 1: 217-243. [3] Caipang CMA, Takano T, et al. Genetic vaccines protect red seabream, Pagrus major, upon challenge with red seabream iridovirus (RSIV)[J]. Fish Shellfish Immunol, 2006, 21: 130-138. [4] Giudice EL, Campbell JD. Needle-free vaccine delivery[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2006, 58: 68-89. [5] Mittal SK. Aggarwal N, Sailaja G, van Olphen A, et al. Immunization with DNA, adenovirus or both in biodegradable alginate microspheres: effect of route of inoculation on immune response[J]. Vaccine, 2001, 19: 253-263.
同类课题研究水平概述
- 在我国，中华鳖的人工养殖只有几十年的历史，尽管发展迅速，但对于中华鳖的研究不够完善，主要集中在形态结构、生态分布、生长繁殖、养殖管理等方面。虽然在中华鳖疾病防治的研究上取得了一定的进展, 但在免疫防护、病害的预测和预报以及健康养殖模式上还有待于进一步深入研究。尤其在最近几年，促进中华鳖健康及疾病的预防已成为增加养殖效率的焦点问题，而免疫接种法防治鳖病是最积极有效的方法之一。目前，许多国家已经制备出了基因工程疫苗，并在实际中应用。在水产养殖方面，欧、美、日本等已成功地将弧菌、产气单胞菌、爱德华氏菌等鱼类病原菌制备成全细胞灭活疫苗，并且用从菌体中提取的脂多糖、胞外蛋白等有效抗原，制备出的单克隆抗体等生物工程疫苗并已商业化生产。中华鳖气单胞菌疫苗研究也已有不少报道,但由于免疫效果差或使用不方便等原因,这些疫苗的推广应用受到限制。为此,本实验将采用可生物降解的高分子聚合物为载体,研制口服缓释微球疫苗。 国外是在50年代开始研制口服缓释、控释制剂,70年代被医学界认可上市的药物品种逐渐增多。国外上市的口服缓释制剂药物品种已有200余种,不同规格的商品计有400种以上。而在国内，口服药物缓释技术的研制尚属起步阶段，仅孙红祥等采用生物降解性高分子聚合物为载体，研制了口服缓释微球灭活疫苗，并作了相关报道。
