基本信息
- 项目名称：
- 白纹伊蚊高效Bt的筛选及细胞受体蛋白分析
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 率先从白玉兰叶片上分离获得了多株Bt野生菌株，筛选获得对白纹伊蚊有高效活性的LLP29菌株。经分子生物学鉴定，发现该菌株的主要杀蚊基因为cyt1基因，国际分类命名委员会将其命名为cyt1Aa6新基因，拥有自主知识产权。经对白纹伊蚊受体蛋白分析，发现Cyt1Aa6毒素蛋白主要结合于白纹伊蚊中肠上，且该毒素蛋白与C6/36细胞特异结合。
- 详细介绍：
- 蚊虫是“四害”之首，不仅刺叮骚扰，而且能传播多种疾病，如登革热、黄热病、疟疾、乙型脑炎等，严重危害人体健康。白纹伊蚊在我国从南向北至沈阳，西北至陇县、宝鸡，西南至西藏都有分布，是我国重要的媒介蚊虫，可传播登革和西尼罗等多种虫媒病毒，而当前的医疗水平还不能根治登革热或西尼罗热等急性虫媒传染病，也尚无有效的疫苗，行之有效的措施只有集中在对其传播媒介-白纹伊蚊的控制上。因此，白纹伊蚊的有效防治是预防和控制登革热和西尼罗热的根本。近年来由于存在抗药性、环境污染以及破坏生态平衡等问题，化学杀虫剂的应用受到环境保护组织和社会的巨大压力。生物防治由于不污染环境、特异性较高、对非靶标生物影响小以及不容易产生抗性等优点，被认为是较为理想的防治手段之一。当今，卫生害虫的生物防治日渐受到医学昆虫界和世界卫生组织（WHO）等有关机构的重视，其中令人瞩目的是利用昆虫病原细菌防治蚊虫方面的研究应用。目前发现和筛选用于生物防治蚊虫的昆虫病原细菌大多集中于苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）和球形芽胞杆菌 (B. sphaericus，简称 Bs)。 Bt是一种革兰氏染色正反应（G+）细菌，主要特性在于形成芽孢的同时在菌体内形成具有蛋白质性质的一个或多个伴胞晶体，又称杀虫晶体蛋白或δ-内毒素。由于这类蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目昆虫及动植物寄生线虫等有较强的毒杀作用，而对人和家畜无毒、不污染环境、不产生抗药性等优点，在全球农、林、卫生害虫防治中得到广泛应用。Bt的杀虫晶体蛋白由cry基因和cyt基因编码，这些基因大多位于染色体外的质粒上。Bt杀虫活性与ICPs的形状、结构和大小均有着密切关系。Bt以色列亚种主要含有Cry4、Cry10、Cry11、Cyt1 和 Cyt2等毒素蛋白，对多种蚊虫有高效活性，已成功开发为生物杀虫剂用于蚊虫和蚋等多种双翅目昆虫的防治，在疟疾、登革热、黄热病和丝虫病等蚊媒疾病的控制上发挥了重要的作用。不同蚊种，甚至同一蚊种不同地理株由于其易感性、受体、靶标位点等存在差异，同时，不同Bt菌株由于本身也存在杀虫活性、杀虫蛋白、作用基因、与受体结合能力和种类等差异，至今还没有Bt对蚊虫作用机理的详尽描述。目前国内外学者研究热点主要集中于毒素蛋白与受体的结合上，这在一定程度上为Bt对蚊虫作用机理的诠释提供了理论依据。白纹伊蚊与登革病毒Ⅱ型中肠感染屏障机理的形成及中肠胰蛋白酶的作用、围食膜的形成均有关。受体决定了蚊虫及组织对病毒的感染特性，因为在埃及伊蚊的中肠上鉴定到受体，而在非登革媒介淡色库蚊中肠上鉴定不到病毒受体。刘美德等也在C6/36细胞上发现登革病毒受体蛋白的存在。杨发青等发现蚊虫中肠感染屏障受感染病毒剂量的影响。与鳞翅目昆虫一致，蚊虫摄食Bt杀虫剂的ICPs，ICPs在中肠碱性条件下二硫键打开，在肠道胰蛋白酶的作用下激活形成抗蛋白酶的毒性核心片断后才有活性。Bt活性蛋白与中肠上皮细胞结合后，有毒性的α-螺旋穿透细胞膜形成一个离子通道（孔），依pH不同，这些孔具有选择性（仅K+可通过）和非选择性（Na+和阴离子可通过），由于碱性中肠和蛋白酶的作用，因而这些孔很有可能有K+渗漏，这种阴离子通道破坏了膜电势，细胞膨胀并裂解，导致中肠坏死，围食膜和上皮退化变性，肠壁受损后，中肠的碱性高渗内含物进入血腔，血淋巴pH升高而导致昆虫麻痹死亡。因此，尽管在不同水平上对ICPs的作用机制已有所了解，但仍缺乏更精确的信息。随着ICPs结构与功能研究的不断深入，必将不断丰富和完善ICPs分子作用机制，为进一步在分子水平上利用基因操作及蛋白质工程技术开发这一潜在有广阔应用前景的微生物杀蚊剂奠定基础。微生物资源的开发、收集和利用是当今世界各国备受关注的热点，许多国家都将其作为产业竞争的一个重要因素，保护和有效利用Bt资源对加速我国微生物农药的产业化进程，提高微生物药物产业在国际市场的竞争力十分必要。然而，关于Bt的生态学意义至今尚未明确，对于Bt是土壤的寄居菌还是叶片的腐生菌也还未能准确描述。白玉兰（Magnolia denudata），俗称“应春花”、“望春花”，在中国有2500年左右的栽培历史，分布于中国中部及西南地区，为庭园中名贵的观赏树。现世界各地均已引种栽培。除了观赏价值，白玉兰不但能作为重要的香精原料，还可作为分离Bt的重要材料。因此，本研究拟从白玉兰叶片中筛选高效杀蚊Bt菌，以白纹伊蚊为对象进行研究，旨在获得高效的Bt杀蚊菌株，明确其杀蚊主效因子，从而诠释杀蚊蛋白对白纹伊蚊的作用机制，为保护和有效利用微生物资源、发展我国生物型卫生杀虫剂及有效预防和控制由白纹伊蚊等媒介蚊虫传播的虫媒传染病提供重要的理论和应用价值。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：获得高效杀蚊Bt菌株，探索其作用机理，为有效控制白纹伊蚊提供重要的理论依据。基本思路：以白玉兰为材料进行Bt菌株分离，以白纹伊蚊昆虫及细胞为靶标进行高效菌株筛选，以昆虫学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等技术进行杀蚊机理研究。
科学性、先进性及独特之处
- 1、材料创新：选择中国有特色的植物进行高效Bt菌株筛选； 2、新基因：鉴定经国际认可并拥有自主知识产权的基因。可以提供于实际应用。
应用价值和现实意义
- 1、分离得到的LLP29菌株对白纹伊蚊有毒杀作用，比目前国内常用的菌株提高毒力12.74%； 2、新基因可以提供用于工程菌构建。
学术论文摘要
- 率先从白玉兰叶片上分离获得了多株苏云金芽孢杆菌（Bt）野生菌株，筛选获得对白纹伊蚊有高效活性的LLP29菌株。经PCR鉴定，该菌株的主要杀蚊基因为cyt1基因，国际分类命名委员会将其命名为cyt1Aa6新基因。通过形态学、基因型、蛋白等研究表明，纯化的Cyt1Aa6毒素蛋白对白纹伊蚊幼虫及其细胞系C6/36细胞都有高效活性，LC50为0.33 μg/mg，IC50为0.025 μg/mg。以白纹伊蚊敏感品系及C6/36细胞进行受体结合试验，免疫组织化学结果表明，Cyt1Aa6毒素蛋白主要结合于中肠上，免疫荧光结合试验显示该毒素蛋白与C6/36细胞为阳性结合。
获奖情况
- 1、Lingling Zhang, Enjiong Huang, Ivan Gelbi, Chunyu Guan, Yi Guan & Xiong Guan. 2009. Cloning, expression and characterisation of a promising mosquitocidal gene. Indian Journal of Experimental Biology, 47：799-803 2、Lingling Zhang, Enjiong Huang, Jing Lin, Ivan Gelbic, Qunlin Zhang, Yi Guan, Tianpei Huang, Xiong Guan. 2010. A novel Mosquitocidal Bacillus thuringiensis Strain LLP29 Isolated from the Phylloplane of Magnolia denudate. Microbiological Research，165：133-141
鉴定结果
- 分离的细菌经过形态学、生理生化、分子生物学鉴定为Bt菌株，所含杀蚊基因为cyt1Aa6基因。
参考文献
- 1、Costechareyre D., Dridi B., Rahbé Y., Condemine G. (2010) Cyt toxin expression reveals an inverse regulation of insect and plant virulence factors of Dickeya dadantii. Environ Microbiol. 12(12):3290-301. 2、Fernandez-Luna M.T., Lanz-Mendoza H., Gill S.S., Bravo A., Soberon M., Miranda-Rios J. (2010) An alpha-amylase is a novel receptor for Bacillus thuringiensis ssp. israelensis Cry4Ba and Cry11Aa toxins in the malaria vector mosquito Anopheles albimanus (Diptera: Culicidae). Environ Microbiol. 12(3):746-757. 3、Perez C, Fernandez L E, Sun J, et al. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Cyt1Aa synergizes Cry11Aa toxin by functioning as a membrane-bound receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2005, 102 (51): 18303-18308.
同类课题研究水平概述
- 国际上多家单位开展相关研究，如University of Califormnia、Université Joseph Fourier (France)、Institut de Recherche Pour le Développement (France)、Universidad Nacional Autónoma de México (Mexico)、University of British Columbia (Canada)、National Institute of Malaria Research (India)、Instituto de Biologia do Exército (Brazil)、University of Alexandria (Egypt)等，国内的华中农业大学和中科院武汉病毒所也开展了关于蚊虫生防的研究，但由于不同蚊种，甚至同一蚊种不同地理株由于其易感性、受体、靶标位点等存在差异，同时，不同Bt菌株由于本身也存在杀虫活性、杀虫蛋白、作用基因、与受体结合能力和种类等差异，至今还没有Bt对蚊虫作用机理的详尽描述,特别是在细胞生物学水平上进行深入解释。
