基本信息
- 项目名称：
- 血管内皮生长因子VEGF165类似物的制备及活性评价
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 本课题是构建带有VEGF165定点突变基因的毕赤酵母表达质粒以及人血清白蛋白VEGF165融合蛋白质粒，并研究其在毕赤酵母中的表达及其工艺条件的优化，以获得高产稳定且具有生物学活性的VEGF165突变体和人血清白蛋白VEGF165融合蛋白，进而对其蛋白活性进行评价。
- 详细介绍：
- 血管内皮生长因子165(VEGF165)是血管内皮生长因子（VEGF）家族中促血管生成活性最强的功能性蛋白，它通过与特异性受体VEGFR-1和VEGFR-2结合，发挥生理功能。VEGF165存在易降解，半衰期较短，天然来源较少等问题。有研究报道表明，在血浆中，VEGF165降解的主要位点为110位、111位，将蛋白药物与人血清白蛋白融合也是提高药物半衰期的常用办法。 本课题从基因水平改造着手，并以毕赤酵母为表达系统，以期获得量大且稳定性较高的具有VEGF165活性的蛋白。本课题的目的是构建带有VEGF165定点突变（编码110位精氨酸突变为赖氨酸，111位丙氨酸突变为脯氨酸）基因的毕赤酵母表达质粒以及人血清白蛋白VEGF165融合蛋白质粒，并研究其在毕赤酵母中的表达及其工艺条件的优化，以获得高产稳定且具有生物学活性的VEGF165突变体和人血清白蛋白VEGF165融合蛋白。 VEGF165突变体采用的方法为用重叠延伸PCR定点突变技术，利用酶切连接的方法将突变后的VEGF165基因片段构建入表达质粒pPIC9k；同时构建VEGF165与人血清白蛋白融合表达质粒，两者分别在毕赤酵母GS115中表达。 利用Heparin-Sepharose CL6B亲和层析对表达产物进行初步纯化，并以人血管内皮细胞（HMEC）为细胞株评价其生物学活性。 实验的结果为SDS-PAGE蛋白电泳分析及Western blot显示突变后的VEGF165可在酵母中高效表达，并以可溶性分子的形式存在于上清液中；生物学活性检测结果显示突变后的VEGF165具有刺激人血管内皮细胞增殖的活性。 本实验的结论是突变后的VEGF165基因可在毕赤酵母表达系统中进行高效分泌性表达，其产物具有刺激人血管内皮细胞增殖的生物学活性。突变后的VEGF165与野生型的VEGF165相比，稳定性是否能被提高，还有待进一步研究。VEGF165融合白蛋白表达质粒构建完毕，待进一步研究。
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 目的和基本思路： 1、VEGF165生物信息学和结构生物学分析 根据VEGF165的结构特征和已被解析的酶解位点的工作积累，采用生物信息学方法，从基因水平设计定点突变位点，并结合白蛋白融合技术设计高活性、稳定和经济的血管内皮生长因子VEGF165类似物。 2、新的VEGF165类似物的制备根据已设计的具有高活性和稳定的VEGF165类似物的结构特征，采用定点突变的手段改造易被纤溶酶降解的部位，构建突变的VEGF165表达系统，实现其在毕赤酵母中分泌表达和制备。初步建立其与白蛋白修饰的融合蛋白，实现了在毕赤酵母中分泌表达。 3、VEGF165类似物的活性评价采用细胞生物学手段，结合功能分析，评价VEGF165类似物对血管形成细胞增殖的影响。 创新点： 1、结合结构生物学的工作积累和生物信息学的分析结果，提出了高活性和稳定的VEGF165类似物的新设计思路。 2、采用定点突变技术改造了VEGF165易被纤溶酶降解的位点，利用白蛋白融合技术制备了长效的VEGF165，获得了高效稳定的VEGF165类似物，在方法上有所创新。 技术关键： 1、定点突变技术。 2、白蛋白融合表达技术。 主要技术指标： 1、发酵产率：≥200mg/L 2、纯化得率：≥20%，纯度：≥85% 3、活性
科学性、先进性
- VEGF165在血管内皮细胞培养、相关科学研究有着广泛的应用，并且在伤口愈合及冠心病的治疗上显示了广阔的前景。VEGF165在体内的半衰期较短（约为90分钟），容易受到体内纤溶酶和其他蛋白酶的作用而降解，构建和制备高效稳定的VEGF165类似物有其明确的应用价值。针对VEGF165的缺陷，项目通过对VEGF165的结构特征分析，设计了高活性且稳定的VEGF165类似物，实现了在毕赤酵母中分泌表达和制备。结合白蛋白融合技术，有望获得高度稳定的VEGF165类似物。上述二种VEGF165类似物查新未见报道。
获奖情况及鉴定结果
- 项目目标产品VEGF165类似物经过与无锡瑞融生物医药有限公司进行合作，已经在无锡、苏州多所科研院所和生物技术公司试用，反映良好。
作品所处阶段
- 中试阶段
技术转让方式
- 生产工艺及工程菌
作品可展示的形式
- 图片和样品
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 使用说明：技术转让，已于2010年10月1日与无锡瑞融生物医药有限公司合作开发。 技术特点和优势：采用生物信息学和分子生物学技术，设计和制备的具有自主知识产权的VEGF165类似物，与市场同类产品比较，具有高活性和稳定的特征，可广泛应用于细胞培养和血管生物学的研究，市场前景广阔。 适用范围：科研院所及生物技术公司 推广前景：项目设计和制备的VEGF165类似物具有高活性和稳定的特征，明显优于同类产品，且制备成本低廉，有着很强的竞争优势。可广泛应用于细胞培养和血管生物学的研究，并有望开发成心脑血管疾病的治疗药物及创伤恢复外用制剂，市场前景广阔。 经济效益预测：目前该类产品在细胞培养和血管生物学研究的市场目前大约在2亿美元，伤口愈合及冠心病药物市场在200亿美元以上。VEGF165经这两种技术改进，获得稳定性好和高活性的VEGF165类似物因其产品的优势特征，将在试剂市场和进一步的药物开发领域得到广泛的应用。
同类课题研究水平概述
- 一、制备方面 目前，国内对于VEGF165制备的实验室的研究较多和产品开发较多，但对VEGF165的衍生产品大多对其表达方面进行研究，而成品化的研究则较少，国内应用的血管内皮生长因子均来源于国外。国外制备情况较国内较好，但是也未见有关VEGF165生产工艺的研究报道。VEGF165主要存在天然来源少、半衰期短，稳定性差等问题。 二、药理学研究方面 VEGF165在药理学方面的基础研究相对与它的制备较广泛，国内外均有大量的报道，通过VEGF165与其受体的作用方面等研究VEGF165基本功能以及出现的新的功能。国内外主要从体外给予重组蛋白VEGF165或者以VEGF165基因转染的方式对其药理学进行研究，具体如下：基因转染方法研究VEGF165功能，如MENG Qing-you等利用VEGF165基因转染内皮细胞中，再移植到患有慢性静脉血栓的老鼠中，VEGF165基因表达VEGF165蛋白，重通毛细管，从而改善该疾病。但是临床研究表示基因转染不能够达到预期治疗的效果。含有VEGF165的复合生物材料修复骨缺损，来促进局部血管生成，增加缺损区血供，为促进骨组织修复奠定基础。如CAO Kai等人利用此方法修复兔子的以VEGF165及其受体作为血管抑制剂的靶点，抗血管治疗从而达到抑制肿瘤的生长和繁殖，最终导致死亡。如Robert S. Kerbel探究抗血管治疗肿瘤的机制，提出了几种杀死肿瘤的机制，这种方法具有很强的特异性，而对正常的细胞无毒性，有很好的治疗肿瘤的疗效。针对VEGF165蛋白不稳定，半衰期短的缺点，目前也有报道通过不同载体介导VEGF165蛋白进入人体，改善其缺点，从而达到治疗的效果。如J. Kastrup等人利用微粒状载体运载VEGF165蛋白，在特定的部位释放，从而达到治疗心肌缺血病的效果。 VEGF及其受体作为靶点治疗肿瘤也是目前研究的热点，如Esther Raskopf等利用siRNA特异性地作用于VEGF，在基因水平抑制VEGF的表达，对肝癌的治疗有很好的效果。本课题能显著延长VEGF165半衰期的突变体VEGF165和HSA-VEGF165融合蛋白等VEGF165类似物在临床上具有广阔的前景。
