基本信息
- 项目名称：
- 美洲商陆果实多糖的确证和含量测定
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 目的：提取商陆果实多糖并确证其中含多糖。方法：采用超声辅助法提取商陆果实中的多糖，提取液用多糖确证实验验证，以葡萄糖为对照，采用分光光度法在610 nm处测定其中的多糖。结果：回归方程为：A = 20.894 C + 0.1677, R = 0.9962。结论 商陆果实中含有多糖，多糖含量为67.8mg/g。
- 详细介绍：
- 美洲商陆（Phytolacca americana Linn.）是商陆科（Phytolaccaceae）商陆属的多年生草本植物，又名垂序商陆、美国商陆。美洲商陆地上高度约为1米～2米，根系肥大，呈倒圆锥形。夏秋季开花。果序下垂，浆果为扁球形，多汁液，熟时紫黑色；种子平滑。全株有毒，根及果实毒性最强。美洲商陆是一种入侵植物，原产北美洲，我国以下省份已有分布：河北、北京、天津、陕西、山西、山东、江苏、安徽、浙江、上海、江西、福建、台湾、河南、湖北、湖南、广东、广西、四川、重庆、云南、贵州、海南。传统入药部位为根，功能：止咳，利尿，消肿。 目前国内外有研究表明，美洲商陆核糖体失活蛋白具有抗病毒的作用，用于动植物体的抗病毒作用，对多种动植物病毒具有广谱抗性。且这种抗病毒蛋白通过抑制人体免疫缺损病毒(即艾滋病病毒)的复制，可达到治疗艾滋病的目的，美国和南非已经用商陆抗病毒蛋白为原料制成了治疗艾滋病新药，其疗效比目前使用的药物高100～1000倍。由此可见，商陆应用前景广阔，可开发利用潜力巨大。植物多糖具有多种生物活性，植物多糖也具显著的抗病毒作用，商陆果实中多糖的研究也没见报道，我们拟对其果实中多糖的进行提取和含量测定，研究结果对有着丰富资源和多种药用活性的商陆开发具有重要的现实意义。 1 仪器与材料 瑞士BUCHI R-200旋转蒸发仪，德国eppendorf Research移液器，上海尤尼柯UV-2102C型紫外分光光度计，昆山KQ3200DE型数控超声清洗器，上海亚荣SHZ-Ⅱ循环水真空泵。北京赛多利斯BT124S电子天平。 硫酸、正丁醇、氯仿、蒽酮、乙醇等为分析纯，水为蒸馏水。 商陆果实2010年9月采集于学校实验田边。 2 实验方法 2.1 样品处理和提取液制备：自然干燥的商陆果实粉末过60目筛，置于干燥器中备用。精确称取上述商陆果实粉末20.00g，置500mL锥形瓶中，加400mL蒸馏水，超声间歇提取2次，每次20min，超声功率100%，合并提取液，减压蒸至约50mL，用sevege法除蛋白，反复4次，用无水乙醚除色素，反复3次，用乙醇醇沉多糖，4℃冰箱静置过夜，4000r/min离心，沉淀定容于250mL容量瓶，即供试样品，待用。 2.2 多糖的确证性实验：取2.1项制备的备用液，分别进行以下多糖确证性实验。 2.2.1 碘试验：加碘试液1滴，观察颜色变化。 2.2.2 多糖水解：加入稀盐酸5滴，置沸水浴中加热5－6分钟，然后用10％氢氧化钠液中和至中性，再加新配制的碱性酒石酸铜试液4滴，另取检液1mL，不加酸水解直接加入上述试液4滴，两管同置水浴上煮沸5－6分钟。比较水解后和未经水解生成棕红色沉淀物的量。 2.2.3 α-萘酚试验：加5％萘酚试液数滴振摇后，沿管壁滴入5－6滴浓硫酸，使成两液层，待2－3分钟后，观察两层液面出现的颜色。 2.3 多糖的含量分析：采用蒽酮—硫酸法，以葡萄糖为对照品，用分光光度计测定吸光度[11-12]。 2.4 对照品溶液的制备：精确称取50.00mg葡萄糖对照品，用蒸馏水溶解后，定容于50mL容量瓶中，即得葡萄糖对照品液(1 mg／mL)。 2.5 最大吸收波长的确定： 取2.4制备的对照品溶液和2.1制备的供试样品溶液，按2.3项方法，在400～700 nm处进行扫描。 2.6 标准曲线的绘制：精密吸取2.4制备的对照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，置干燥试管中，按2.3项方法在2.5项选定的波长处测定吸光度，每个浓度平行测定3 次，以A值3次的平均值纵坐标，葡萄糖浓度C为横坐标绘制标准曲线，经线性回归得回归方程。 2.7 精密度实验：精密吸取对照品溶液1.0 mL，共5份，按2.3项法操作，测定吸光值，计算RSD。 2.8 稳定性实验：精密吸取2.4中制备的对照品溶液1.0 mL和2.1中制备的样品溶液0.5mL，按2.3法操作，在50min内，每隔10 min测定吸光值，计算RSD。 2.9 加样回收实验 准确取2.1中制备的样品液 0.5mL各6份，分别加入0.4mL对照品葡萄糖溶液，按2.3法测定多糖含量，计算RSD。 2.10 商陆果实多糖含量测定： 取2.1制备的供试样品溶液0.5mL，按2.3项方法测定吸光度，平行测定3 次，以A值3次的平均值代入回归方程计算商陆果实多糖的含量。 3 实验结果 3.1 多糖的确证性实验 3.1.1 碘试验：提取的商陆果实多糖溶液加碘试液没有变蓝。 3.1.2 多糖水解：提取的商陆果实多糖溶液经水解后，加入加新配制的碱性酒石酸铜试液，有棕红色沉淀物。未水解的商陆果实多糖溶液，加入加新配制的碱性酒石酸铜试液没有棕红色沉淀。 3.1.3 α-萘酚试验：提取的商陆果实多糖溶液加5％萘酚试液和浓硫酸后，两液层面之间有紫红色环生成。 3.2 最大吸收波长： 对照溶液的最大吸收波长在610nm，供试样品溶液的最大吸收波长在610nm，较大吸收波长在610nm，所以选定610nm作为测定波长。 3.3 标准曲线：经线性回归得回归方程为：A = 28.894C + 0.1677，R = 0.9962 。 图1 葡萄糖标准曲线 Fig.1 The standard curve of the Glucose standard samples 3.4 精密度实验结果：见表1 表1 硫酸-蒽酮法精密度实验结果 Table 1 The precision test by sulphuric acid-anthrone 序号 1 2 3 4 5 6 RSD 吸光度(葡萄糖) 2.193 2.184 2.227 2.214 2.167 2.173 1.07% 3.5 稳定性实验结果：见表2。 表2 硫酸-蒽酮法稳定性实验结果 Table2 The stability test by sulphuric acid-anthrone 时间 min 0 10 20 30 40 50 RSD 吸光度(葡萄糖) 3.134 3.132 3.129 3.124 3.124 3.124 0.144% 吸光度(样品) 0.666 0.660 0.658 0.657 0.658 0.657 0.523% 3.6 加样回收实验结果：见表3。 表3 硫酸-蒽酮法加样回收率实验结果 Table 3 The recovery test by sulphuric acid-anthrone 样品 Sample 多糖含量mg Conlent 加标量mg Added 加标后总糖含量mg Found 回收率% Recovery 平均回收率% Average recovery RSD 商陆果实 3.7 商陆果实多糖含量：经带入回归方程计算，商陆果实多糖含量为67.8mg / g。 4 结论与讨论 4.1 在确证性实验中，提取液与碘试液的颜色反应显示商陆果实中不含淀粉类；多糖水解前后的沉淀反应说明商陆果实多糖提取液中不含还原糖；α-萘酚试验生成的紫色环预试提取液中可能有多糖。确证实验结果表明，商陆果实中含有多糖类成分。目前商陆果实中多糖成分研究未见报道，我们提取商陆果实中的多糖类化合物，并经多糖的确证性实验证实商陆果实中含有多糖，用蒽酮-硫酸法测得商陆果实多糖的含量为 67.8mg / g 。 4.2 药用植物活性成分的提取方法很多，经典的有浸渍法、渗辘法、煎煮法、回流提取法、连续提取法等，现代提取方法有超声提取、酶解提取、超临界流体萃取、加压液体萃取、微波辅助提取等。现代提取技术一般具有用时短、效率高等优点。目前植物多糖的提取主要采用以下方法：溶剂提取、微波辅助提取、超声波和酶法提取。溶剂提取法的原理是相似相溶准则。多糖属极性较强物质，溶于热水。因此采用水煎煮法能够直接提取植物多糖。水提取植物多糖操作简便、成本低廉，至今仍在科研、生产领域中广泛使用；微波提取则是利用微波场中介质的偶极子转向极化和界面极化的时间与微波频率相吻合的特点，促使介质滚动能级跃迁，加剧热活动，将电能转化为热能，从而使细胞壁粉碎或溶解，达到加强提取效率的目的；超声波提取植物多糖是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的溶出，另外超声波发生的机械振动、乳化、击碎、化学效应等也能加速多糖成分的扩散开释并充分与溶剂混合，利于提取。我们用水为提取剂，采用超声波提取商陆果实多糖成分。
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撰写目的和基本思路
- 美洲商陆（Phytolacca americana Linn.）是商陆科商陆属的多年生药用草本植物，入《中国药典》。美洲商陆果实中多糖的研究尚没见报道，植物多糖具有多种生物活性，我们拟提取其果实中的多糖、并经确证性实验，最后进行含量测定。
科学性、先进性及独特之处
- 美洲商陆是一种入侵植物，原产北美洲，我国贵州等20多个省份已有分布，资源极为丰富。多糖具有多种生理活性，美洲商陆果实多糖未见报道，我们对其果实多糖的确证研究为含量测定方法的确定提供理论依据，其含量测定的结果又为美洲商陆果实多糖开发提供基础。现在植物多糖在动物养殖中作为绿色添加剂是该行业的新兴研究热点，随着深入研究，美洲商陆果实中多糖有望成为动物饲料添加剂行业中的新成员，服务社会。
应用价值和现实意义
- 目前国内外对美洲商陆核糖体失活蛋白又较深入的研究，利用用商陆抗病毒蛋白为原料已制成了治疗艾滋病新药。美洲商陆中多糖、黄酮、皂苷等成分的研究也有报道。但美洲商陆果实中多糖的研究未见报道，植物多糖具有多种生物活性。我们的研究成果对有着丰富资源和多种药用活性的商陆开发具有重要的意义。随着深入研究，美洲商陆果实中多糖有望成为动物饲料添加剂行业中的新成员，服务社会。
学术论文摘要
- 美洲商陆（Phytolacca americana Linn.）是商陆科（Phytolaccaceae）商陆属的多年生药用草本植物，入《中国药典》，又名垂序商陆、美国商陆。美洲商陆地上高度约为1米～2米，根系肥大，呈倒圆锥形。夏秋季开花。果序下垂，浆果为扁球形，多汁液，熟时紫黑色；种子平滑。全株有毒。目前国内外有研究表明，美洲商陆核糖体失活蛋白具有抗病毒的作用，且这种抗病毒蛋白通过抑制人体艾滋病病毒的复制，可达到治疗艾滋病的目的，美国和南非已经用商陆抗病毒蛋白为原料制成了治疗艾滋病新药，其疗效比目前使用的药物高100～1000倍。美洲商陆中多糖、黄酮、皂苷等成分的研究也有报道，作为富集重金属锰的植物，美洲商陆也是植物修复技术中的重要植物。由此可见，美洲商陆应用前景广阔，可开发利用潜力巨大。但是美洲商陆果实中多糖的研究未见报道，植物多糖具有多种生物活性，也具显著的抗病毒作用，我们对其果实中多糖的进行提取、确证和含量测定，经多糖确证性实验确证其中含多糖。商陆果实中含有多糖，多糖含量为67.8mg/g。我们的研究成果对有着丰富资源和多种药用活性的商陆开发具有重要的意义。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- 1] 肖培根.新编中药志(第一卷) [M ].北京:化学工业出版社, 2001, 926. [2] 中国药典.2005版一部[M]. 北京: 化学工业出版社. [3] 杨宇, 王锡锋, 吴元华.美洲商陆抗病毒蛋白及其在植物病害防治中的应用[J]. 中国植保导刊, 2006,26(6):23–25. [4] 赵玉, 王锡锋, 周广和, 等.2 个不同缺失型美洲商陆抗病毒蛋白基因在大肠杆菌中的表达[ J] . 植物病理学报, 2005, 35( 3) : 270–271. [5] 马萧, 祝水金, 丁伟, 等. 美洲商陆粗提物对烟草花叶病毒的控制作用[ J] .西南农业大学学报, 2005, 18( 2) : 168–171. [6] 林爱玉,王秋颖.美州商陆抗病毒蛋白及其在艾滋病治疗中的作用[J].中草药,2003,9:附3-附6． [7] 丰贵鹏.多糖结构的研究方法及其活性的研究进展[J] .平原大学学报,2006,23 (5):128-130. [8 ] 韩果萍 ,段玉峰.我国天然活性多糖药理研究进展[J ] .中药材, 2003 , (2) :139–141. [9] 王长云, 管华诗. 多糖抗病毒作用研究进展[J] . 生物工程进展,2000 ,20(1) :17–20 . [10] 田英, 董俊兴. 天然产物中抗艾滋病病毒活性成分的研究进展[J] . 中国中药杂志,2002,23[11] 黄瑞松. 中草药多糖含量测定方法概述[J].中国药师,2005, 8(1): 68 – 70. [12] 刘晓涵, 陈永刚, 林 励,等.蒽酮硫酸法与苯酚硫酸法测定枸杞子中多糖含量的比较[J].食 品 科 技, 2009, 34 (9) :270-272. [13] 蔡凌云,黎云祥,陈蕉等.白簕多糖的提取工艺和含量比较[J].光谱实验室,2009,26(2):251-257.
同类课题研究水平概述
- 植物多糖以其广泛而强大的生理活性成为生命科学领域的研究热点，有学者预言：“二十一世纪将是多糖时代”。 药用植物活性成分的提取方法很多，经典的有浸渍法、渗辘法、煎煮法、回流提取法等，现代提取方法有超声提取、超临界流体萃取、加压液体萃取、微波辅助提取等。目前植物多糖的提取主要采用以下方法：溶剂提取、微波辅助提取、超声波和酶法提取。多糖属极性较强物质，溶于热水。因此采用水煎煮法能够直接提取植物多糖。水提取植物多糖操作简便、成本低廉。超声波提取植物多糖是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的溶出，另外超声波发生的机械振动、乳化、击碎、化学效应等也能加速多糖成分的扩散开释并充分与溶剂混合，利于提取。我们用水为提取剂，采用超声波提取商陆果实多糖成分。多糖的测定方法很多，目前还没有国家规定的方法，其中一类测定方法，也是现在普遍使用的方法，即利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，然后再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质这一性质进行测定，如蒽酮-硫酸法。我们采用葡萄糖为对照品，采用蒽酮-硫酸法在610nm处测定美洲商陆果实中多糖的含量。目前多糖含量测定中作标准曲线大部分都是用葡萄糖来做标准品，而不是用葡聚糖（MW500，000），因为葡聚糖标准品国内难求且价格昂贵。但是植物活性的水溶性多糖均由β(1—3)或β(1—6)糖苷键连接葡聚糖构成主链和支链，有的甚至就是β-葡聚糖，用葡萄糖作标准品测定植物中的多糖含量时就会有偏差，我们以后的研究拟用葡聚糖作标准品去进行上述实验。目前国内外对美洲商陆的研究表明，美洲商陆核糖体失活蛋白具有抗病毒的作用，用于动植物体的抗病毒作用，这种抗病毒蛋白通过抑制人体免疫缺损病毒(即艾滋病病毒)的复制，可达到治疗艾滋病的目的，美国和南非已经用商陆抗病毒蛋白为原料制成了治疗艾滋病新药，其疗效比目前使用的药物高100～1000倍；美洲商陆中多糖、黄酮、皂苷等成分的研究也有报道；作为富集重金属锰的植物，美洲商陆也是植物修复技术中的重要植物。但美洲商陆果实中多糖的研究未见报道，植物多糖具有多种生理活性，也具有抗病毒的确切疗效。现在植物多糖在动物养殖中作为绿色添加剂是该行业的新兴研究热点，我们的研究成果对有着丰富资源的入侵植物美洲商陆的开发具有重要的意义。
