基本信息
- 项目名称：
- 缓释型rhBMP-2/CS生物型骨修复材料的制备及活性鉴定
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 骨移植是骨损伤缺损一种必要的治疗方式，传统的自体骨移植具有很多缺陷，因此急需进行骨移植替代物的研究。BMP-2是BMP家族中骨诱导作用最强的成员，其半衰期短易降解代谢。我们利用CS与rhBMP-2复合制备缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料不仅具有良好的生物相容性和力学性能，而且保持了rhBMP-2的生物活性实现持续缓慢释放，能更好地满足各种原因所致骨缺损的修复要求，临床应用前景十分明朗。
- 详细介绍：
- 缓释型rhBMP-2/CS生物型骨修复材料 的制备及活性鉴定 摘 要 背景：重组人骨形态发生蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein，rhBMP-2）在体内半衰期短、易降解代谢，达不到理想的骨再生效果，定位缓释技术已成为解决这一难题的研究热点。 目的：将负载rhBMP-2的壳聚糖（chitosan，CS）膜复合于材料表面制备缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料，并观察其缓释性能、骨诱导活性。 方法：①rhBMP-2与CS混合制备壳聚糖膜，涂覆于生物骨修复材料表面，ELISA方法对其体外释药性质进行检测。②茜素红染色检测缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料诱导C2C12细胞骨钙蛋白（Osteocalcin, OC）形成，观察其诱导成骨细胞的能力。③清洁级KM小鼠股部肌袋内植入埋植物，2周后取材进行Ca2＋离子含量测定，评价其异位骨诱导能力。 结果与结论：①扫描式电子显微镜观察材料表面的壳聚糖膜分布均匀，负载的rhBMP-2呈团簇状。②rhBMP-2/CS生物骨修复材料体外释药存在突释，前4天的释放量达总药量的50%，持续至12天，释药量达到90%，第18天时释放完全。③缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料诱导4周后，C2C12细胞表达成骨晚期分化标志基因OC。④术后2周，小鼠股部肌袋埋植物的Ca2＋离子含量测定缓释型rhBMP-2/CS生物型骨修复材料的骨诱导活性显著增强。结果提示该缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料缓释性能好，显著增强骨形成，具有临床应用的可行性。 关键词：缓释；rhBMP-2；壳聚糖；骨修复材料；骨形成 外伤、炎症、肿瘤、骨骼异常和手术切除等引起的骨缺损修复一直是医学界面临的重要课题。BMP-2是骨形成与骨修复过程中的关键细胞因子[1, 2]。已有研究证实BMP-2对于成骨细胞、软骨细胞的分化以及功能具有重要的调节作用[3, 4]，无论是体内还是体外实验均表明，BMP-2都能促进胚干细胞[5]、间质细胞[6]、成肌细胞[7]向成骨细胞的分化，诱导碱性磷酸酶（ALP）、骨钙蛋白、I型胶原的表达显著上调，是BMP家族中骨诱导作用最强的成员。由于BMP-2在溶液中半衰期短，达不到理想的骨再生效果，因此怎样在体内获得BMP-2的持续释放，延长作用时间成为研究的热点[8]。高分子壳聚糖（chitosan，CS）具有促进吸收、黏膜黏附和可控制药物释放的功能，负载蛋白质类药物，能够对蛋白质进行有效的保护，避免药物的快速降解，提高药物的稳定性，增强骨填充材料的组织相容性[9, 10]。本研究利用壳聚糖与重组骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）复合形成负载rhBMP-2的壳聚糖膜，涂覆于生物型骨修复材料表面，制备缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料，并对其缓释性能、骨诱导活性进行比较、探讨。 1. 材料和方法 1.1 材料：rhBMP-2冻干粉由暨南大学生物工程研究所老师提供，为大肠杆菌表达、复性、纯化所得[11]；壳聚糖：脱乙酰度DD=85%，黏度200cps，购自Aldrich公司；生物型骨修复材料（由冠昊生物科技有限公司提供），为猪骨来源；rhBMP-2 ELISA检测试剂盒（购自美国PeproTech公司）；悬臂式搅拌机（德国IKA公司）；全波长扫描多功能酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；茜素红等试剂（购自Sigma公司）；鼠源C2C12成肌细胞株（购自ATCC）。清洁级KM小鼠40只，由中山大学动物试验中心（《实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2004-0011》和《实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2007-0081》）提供，雄性，18～22g，随机分成4组，分别为rhBMP-2/CS复合材料组、rhBMP-2复合材料组、单纯骨填充材料组。实验过程中对动物的处置参照国家科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[12]。 1.2 方法： 1.2.1 rhBMP-2/CS生物型骨修复材料的制备方法按如下步骤进行： ①CS溶于2% (v/v)的乙酸溶液，配成浓度为0.1％的溶液，将生物型多孔骨修复材料负压下浸入上述制成的溶液中，保持2小时，取出晾干，SEM观察CS的成膜性。②如前配制CS的乙酸溶液，然后在搅拌下，按rhBMP-2与CS的质量比为0.01∶1的比例加入rhBMP-2，混合均匀后再如前步骤复合于材料表面后，经环氧乙烷或辐照灭菌，包装，即制成rhBMP-2/CS生物型骨修复材料，成品为每11mg生物型多孔骨修复材料负载有10μg rhBMP-2。 1.2.2 缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料体外释药实验研究 10个5ml离心管内中分别盛入2ml PBS（pH7.4）和0.02%叠氮钠（w/v），随机分成2组，分别为rhBMP-2/CS复合材料组、对照组，rhBMP-2/CS复合材料组每个管内加入缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料11mg，对照组每个管内加入rhBMP-2复合材料（生物骨修复材料负压下浸入rhBMP-2的尿素溶液中，保持0.5～2小时，取出晾干，灭菌即得，成品亦为每11mg生物骨修复材料负载有10μg rhBMP-2），摇匀，置于37℃孵箱内，持续搅拌，记录释药起始时间。分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h～21天各取50μl上清（同时补入新鲜PBS），离心，人BMP-2 ELISA试剂盒检测上清液中rhBMP-2含量。ELISA检测时用抗人BMP-2 capture antibody 37℃包被过夜，1%BSA封闭2.5h，加入各不同时间点所取上清，37℃反应2h后加入detection antibody，室温反应2个小时后加入HRP稀释液，室温反应30min后加入显色液显色，全波长扫描多功能酶标仪读取A405，根据绘制的人BMP-2标准曲线计算出各不同时间点上清中rhBMP-2的含量。对结果进行百分比统计，描绘累计释药曲线。 1.2.3 缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料诱导C2C12细胞骨钙蛋白（OC）形成 细胞以1x104个/cm2接种于24孔板中，每孔加入500µl含10%FBS的DMEM，设单纯骨填充材料对照组，分别将11mg缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料、rhBMP-2生物骨修复材料和10mMβ-甘油磷酸钠共同诱导4周后，细胞用PBS洗2次，根据文献[13]报道方法染色，70%乙醇于-20℃固定60min，晾干，10mg/ml茜素红作用15min，双蒸水洗3-4次，PBS孵育20min，风干，倒置相差显微镜镜下观察并拍照。 1.2.4 缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料诱导小鼠异位骨形成 根据BMP-2质量标准[14]，小鼠股部肌袋埋植实验检测缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料诱导异位骨形成的能力，清洁级KM小鼠30只，雄性，18～22g，随机分成3组，分别为rhBMP-2/CS复合材料组、rhBMP-2复合材料组、单纯骨填充材料组。巴比妥钠腹腔注射麻醉后，暴露右侧大腿股部肌肉，分别将各组材料植入到KM小鼠的后腿肌肉内，进行埋植实验，术后两周取出埋植物进行新生骨Ca2＋离子含量测定，评价各组材料异位骨诱导情况。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。 统计学分析：实验数据均以xˉ±s表示，组间差异采用两样本均数t检验、完全随机设计的单因素方差分析，应用SPSS 12.0统计软件进行处理。 2. 结果 2.1 rhBMP-2/CS生物骨修复材料的SEM观察 复合前生物骨修复材料是多孔的，空隙大小不均，表面有白色颗粒状物质；复合的CS膜在材料表面覆盖比较均匀；复合负载rhBMP-2的CS膜后，材料表面明显观察到有团簇状的物质，且分布均匀，说明rhBMP-2和CS形成了均一的药膜覆盖于材料表面。见图1。 2.2缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料体外药物释放曲线 将生物骨修复材料负压下浸入制成的rhBMP-2/CS溶液中时， 95%±3的rhBMP-2可被吸附到生物骨修复材料上，成品为每10μg rhBMP-2复合于11mg生物骨修复材料。体外药物释放曲线显示，复合的rhBMP-2至少能在12天的时间内实现持续释放，前4天的释放量达到总药量的50%，然后持续至12天时，释药量达到90%，在第18天时药物释放完全。对照组为rhBMP-2复合材料组，在6h时药物即完全释放。 2.3缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料诱导C2C12细胞OC形成 OC是一个维生素K依赖、维生素D诱导的钙连基质蛋白, 它是成骨细胞成熟的标志[15]。取对数生长期C2C12细胞接种于24孔板中，分别将11mg缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料、rhBMP-2生物骨修复材料和10mMβ-甘油磷酸钠共同诱导，设单纯骨填充材料对照组，4周后进行茜素红染色，检测OC表达情况，OC阳性细胞呈桔红色染色。结果显示，对照组几乎没有细胞呈阳性，rhBMP-2生物骨修复材料组可见部分细胞呈阳性染色，而经缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料诱导的C2C12细胞绝大多数都被染成桔红色，由此说明rhBMP-2与CS成膜后由于缓释作用，导致rhBMP-2的持续释放，从而在较长时间内诱导C2C12细胞向成骨晚期分化的能力明显增强。 2.4缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料诱导小鼠异位骨形成 小鼠股部肌袋埋植实验中，两周后取出埋植物进行新生异位骨Ca2＋离子含量测定，结果显示与单纯骨填充材料组以及rhBMP-2生物骨修复材料组相比，该缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料诱导小鼠异位骨形成的能力显著增强（P﹤0.05）。 3、讨论 骨移植是骨损伤与骨缺损一种必要的治疗方式，是临床上仅次于输血的、应用最多的异体移植技术。在骨移植手术中，传统的自体骨移植虽然理想，但是具有很多缺陷，如供骨区损伤、手术出血量大、植骨量不足、不能制备特殊形状、由于延迟愈合甚至不愈合所引起的二次手术比率高等等，因此急需进行骨移植替代物的研究。国外已有大量临床研究表明[16,17]，rhBMP2能显著提高骨折、腰椎间盘退变性疾病等患者手术中的骨融合比率以及一次性手术成功率，无论是与自体骨移植物联用，还是与假体替代物联用，均具有非常明显的治疗优势，能显著促进创口愈合、减少二次手术比率、减少术中出血量、降低整体手术伤害，并能降低患者创口感染率，减少患者的手术痛苦，临床应用前景十分明朗。 由于骨缺损的修复是一个相对缓慢的过程，而rhBMP2在水相及室温环境下易于失去生物活性，在体内还存在酶解作用，直接使用会很快失活，达不到理想的骨再生效果，怎样实现rhBMP2的定位缓释成为研究的热点[18,19]。因此，我们利用高分子壳聚糖对生物骨修复材料表面进行改性，形成负载有治疗有效量的rhBMP-2的壳聚糖膜复合到材料表面，制备缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料，SEM观察形成的壳聚糖膜覆盖面积大，分布均匀。体外释药检测曲线存在突释期，前4天的释药量达到50%，分析原因可能为早期释放时覆盖于材料表面的壳聚糖膜表面积较大，释放量大所形成的，后期释放时由于主要从材料孔隙释药，速度变慢，从而显示至少能在12天内实现rhBMP-2的缓慢持续释放，至12天时释药量达到90%。 体外、体内实验结果均表明此缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料具有较强的骨再生活性，体外诱导C2C12细胞向成骨细胞分化，表达成骨晚期指标---骨钙蛋白，与对照组、rhBMP-2直接复合组相比，缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料诱导C2C12细胞向成骨晚期分化的能力显著增强，说明rhBMP-2与CS成膜后的缓慢持续释放保证了较长时间内rhBMP-2的骨诱导活性，除此之外，也间接说明了此CS膜对rhBMP-2具有一定的保护作用，避免其由于降解而失活，具体原因有待进一步实验证实。体内实验与单纯骨填充材料、非缓释型rhBMP-2复合材料比较，能明显促进小鼠肌袋异位骨的形成。因此，我们制备的缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料，不仅具有良好的生物相容性和力学性能，而且可以保持rhBMP-2的生物活性，并实现rhBMP-2的持续缓慢释放，能更好地满足创伤、感染、肿瘤及发育异常等原因所致骨缺损的修复要求。 另外，在本研究中我们发现CS与rhBMP-2混合后能在材料表面形成均匀的药膜并且缓释性能较好，考虑到目前使用的材料为异种骨来源，虽经过处理，但仍具有一定的免疫原性，临床应用受限，因此我们下一步准备单独将CS与rhBMP-2混合比例进行优化、冻干后制备壳聚糖药膜，并对其理化性能作进一步研究（溶胀性、对rhBMP-2的保护等），以期为rhBMP-2/CS膜在临床的应用提供理论和物质基础。 4、参考文献 [1] Urist MR. Bone: formation by autoinduction. Science. 1965;150:893-899. [2] Takahashi Y, Yamamoto M, Tabata Y. Enhanced osteoinduction by controlled release of bone morphogenetic protein-2 from biodegradable sponge composed of gelatin and beta-tricalcium phosphate. Biomaterials. 2005;26(23):4856-4865. [3] Cowan CM, Aalami OO, Shi YY, et al. Bone morphogenetic protein 2 and retinoic acid accelerate in vivo bone formation, osteoclast recruitment, and bone turnover. Tissue Eng. 2005;11(3-4):645-658. [4] Zuscik MJ, Ma L, Buckley T, et al. Lead induces chondrogenesis and alters transforming growth factor-beta and bone morphogenetic protein signaling in mesenchymal cell populations. Environ Health Perspect. 2007;115(9):1276-1282. [5] Yamashita A, Takada T, Narita J, et al. Osteoblastic differentiation of monkey embryonic stem cells in vitro. Cloning Stem Cells. 2005;7(4):232-237. [6] Meinel L, Hofmann S, Betz O, et al. Osteogenesis by human mesenchymal stem cells cultured on silk biomaterials: comparison of adenovirus mediated gene transfer and protein delivery of BMP-2. Biomaterials. 2006;27(28):4993-5002. [7] Zhao B, Katagiri T, Toyoda H, et al. Heparin potentiates the in vivo ectopic bone formation induced by bone morphogenetic protein-2. J Biol Chem. 2006;281(32):23246-23253. [8] Oju J, Su JS, Sun WK, et al. Enhancement of ectopic bone formation by bone morphogenetic protein-2 released from a heparin-conjugated poly (L-lactic-co-glycolic acid) scaffold. Biomaterials. 2007;28:2763-2771. [9] Lai WF, Marie CM L. Nucleic acid delivery with chitosan and its derivatives. J Control Release. 2009;134(3):158-168. [10] Ander A, Ana C, Viviana R, et al. Chitosan Film as rhBMP2 Carrier: Delivery Properties for Bone Tissue Application. Biomacromolecules. 2008;9(2):711-718. [11] 一种重组人骨形成蛋白-2的表达方法. 专利号: ZL 2006 0032800.7 [12] 中华人民共和国科学技术部. 关于善待实验动物的指导性意见. 2006-09-30. [13] Chaudhary LR, Hofmeister AM, Hruska KA. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 2004;34(3):402-411. [14] 王军志. 生物技术药物研究开发和质量控制(第二版)[M]. 北京: 科学出版社, 2007:794-799. [15] Stein GS, Lian JB, Owen TA. Bone cell differentiation: a functionally coupled relationship between expression of cell-growth and tissue-specific genes. Curr-Op in-Cell-Biol. 1990;2(6) 1018-1227. [16] Garrison KR, Shemilt I, Donell S, et al. Bone morphogenetic protein (BMP) for fracture healing in adults. Cochrane Database Syst Rev. 2010;16(6):CD006950. [17] Axelrad TW, Einhorn TA. Bone morphogenetic proteins in orthopaedic surgery. Cytokine Growth Factor Rev. 2009;20(5-6):481-488. [18] McKay WF, Peckham SM, Badura JM. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). Int Orthop. 2007;31(6):729-734. [19] Mieszawska AJ, Kaplan DL. Smart biomaterials - regulating cell behavior through signaling molecules. BMC Biol. 2010;19(8):57-59
作品图片
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 由外伤、炎症、手术切除等引起的骨缺损修复一直是医学界面临难题。已有研究证实BMP-2是BMP家族中骨诱导作用最强的成员，但是 BMP-2在溶液中半衰期短。高分子壳聚糖（CS）具有促进吸收和可控制药物释放的功能。因此，我们利用CS与rhBMP-2复合形成负载rhBMP-2的壳聚糖膜涂覆于生物型骨修复材料表面，制备缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料，并对其缓释性能、骨诱导活性进行检测
科学性、先进性及独特之处
- hBMP2与壳聚糖类大分子复合形成缓释型壳聚糖药膜，并以骨填充材料为支撑物制备缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料，实现了rhBMP2的定点缓释，为解决rhBMP2的临床应用难题提供了基础。
应用价值和现实意义
- 传统的自体骨移植虽然理想，但是具有很多缺陷，因此急需进行骨移植替代物的研究。我们制备的缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料，不仅具有良好的生物相容性和力学性能，而且可以保持rhBMP-2的生物活性，并实现rhBMP-2的持续缓慢释放，能更好地满足创伤、感染、肿瘤及发育异常等原因所致骨缺损的修复要求，临床应用前景十分明朗。
学术论文摘要
- 背景：重组人骨形态发生蛋白2在体内半衰期短易降解代谢，达不到理想的骨再生效果，定位缓释技术已成为解决这一难题的研究热点。 目的：将负载rhBMP-2的壳聚糖（chitosan，CS）膜复合于材料表面制备缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料，并观察其缓释性能、骨诱导活性。 方法：①制备缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料，用ELISA方法对其体外释药性质进行检测。②茜素红染色检测其诱导C2C12细胞骨钙蛋白（OC）形成，观察其诱导成骨细胞的能力。③清洁级KM小鼠股部肌袋内植入埋植物，2周后进行Ca2＋离子含量测定，评价其异位骨诱导能力。 结果：①扫描式电子显微镜观察，负载的rhBMP-2呈团簇状。②它体外释药存在突释，第18天时释放完全。③诱导4周后，C2C12细胞表达成骨晚期分化标志基因OC。④术后2周， Ca2＋离子含量测定表明其骨诱导活性显著增强。结果提示料缓释性能好，显著增强骨形成，具有临床应用的可行性。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- 1. Urist MR. Bone: formation by autoinduction. Science. 1965;150:893-899 2.Takahashi Y, Yamamoto M, Tabata Y. Enhanced osteoinduction by controlled release of bone morphogenetic protein-2 from biodegradable sponge composed of gelatin and beta-tricalcium phosphate. Biomaterials. 2005;26(23):4856-4865.
同类课题研究水平概述
- 临床上由于各种创伤与疾病造成的骨损伤与骨缺损极为常见，骨移植对于提供支持、填充骨腔、加速骨缺损愈合是一种必要的治疗方式，传统的自体骨移植仍是目前最理想的骨移植材料，是骨移植的“金标准”，但是具有很多缺陷，如供骨区损伤、手术出血量大、二次手术比率高等等，因此促进了骨移植替代材料的研究。随着科学技术进步和生产力的迅速发展，人们生活水平得以提高，如何改善临床治疗和修复水平以增进患者的健康和生命质量正日益受到政府和社会的广泛关注和重视，其研究焦点之一集中在对新型生物医用材料的探索上。 骨形态发生蛋白属于转化生长因子 TGF-β家族的一员，具有独特的诱导成骨能力，在体内诱导未分化间充质细胞分化形成软骨和新生骨，在体外则能诱导骨髓腔内骨髓源性干细胞，关节腔内的脂肪组织、髌韧带组织和滑膜组织的细胞分化为软骨细胞。其中诱骨活性较强的成员为BMP2、BMP7，可使断骨快速再接和缺骨快速再生，在骨科、口腔科和矫形外科具有广泛的应用前景，是目前组织工程和再生医学领域最受人瞩目的细胞因子。 大量研究表明，BMP能在原来的成骨部位诱导骨的形成，并与自体骨融合，诱导形成的新骨具有良好的结构和强度，提示能有效的应用于临床治疗，美国FDA也于2002年7月批准重组骨形态发生蛋白-2用于脊柱融合。国外已有临床研究研究报告[16,17]，rhBMP2能显著提高骨折、腰椎间盘退变性疾病等患者手术中的骨融合比率以及一次性手术成功率，无论是与自体骨移植物联用，还是与假体替代物联用，均具有非常明显的治疗优势，能显著促进创口愈合、减少二次手术比率、减少术中出血量、降低整体手术伤害，并能降低患者创口感染率，减少患者的手术痛苦，应用于一般性的骨折治疗，可使疗程缩短一半以上，临床应用前景十分明朗。 由于骨缺损的修复是一个相对缓慢的过程，而rhBMP2在水相及室温环境下易于失去生物活性，在体内还存在酶解作用，直接使用会很快失活，达不到理想的骨再生效果，怎样实现rhBMP2的定位缓释成为研究的热点[18,19]。因此，我们利用高分子壳聚糖对生物骨修复材料表面进行改性，形成负载治疗有效量的rhBMP-2的壳聚糖药膜复合到材料表面，制备缓释型rhBMP-2/CS生物骨修复材料，SEM观察形成的壳聚糖膜的物理性能，检测体外释药曲线，骨钙素形成检测，体内异位骨形成实验检测其诱导骨形成的生物活性。
