基本信息
- 项目名称：
- 超痕量蛋白质检测方法的研究--基于分子仿生学原理的纳米金共振散射探针
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 作品研究基于分子仿生学原理的超痕量蛋白质定量检测用纳米金探针；以纳米金共振散射光谱特征分析为基础建立新型超痕量蛋白质检测方法（已获国家发明专利）并研发配套分析软件。研究各指标达到该领域世界前沿水平，已发表论文三篇。研究为新型蛋白检测方法在科学研究、临床诊断及食品安全等领域中实现超痕量蛋白质稳定、灵敏的分析开辟新思路，也提供必备的理论基础和经验支持。作品得到蒋大宗先生和哈佛联合研究中心专家的推荐。
- 详细介绍：
- 随着纳米技术领域的快速发展，基于纳米金光学特性的超微量生物分子信息分析技术成为生物医学等相关领域的新兴研究焦点。以纳米金为核心研制的各种用于科学研究、临床诊断、食品安全和环境质量监测的生物光谱学分析探针，在超微量分子识别、肿瘤早期诊断、食品安全快速检测、水质监测等方面发挥重要的作用，具有广阔的应用前景。 目前，市场上高端的商业化纳米金试剂的制备技术为IMI公司（美国）、ROCHE公司（德国）、Nycomed 公司（法国）等跨国集团所垄断，其产品具有粒径均匀、性能稳定、表面修饰基团多样等优势，但工艺流程复杂、反应条件苛刻、产品价格昂贵。由于纳米金试剂制备属尖端技术领域，贸易壁垒高，而国内上市的同类产品在性能指标方面同上述公司还有相当差距。 本研究首次利用树状体PPIHA（Polpyropylneimine hexadeacamnie dendrimer，聚苯丙烯亚胺）一步制得表面氨基活化的纳米金探针，获得了表面修饰纳米金的新型制备工艺，成本降至进口同类产品的1/53。继而，突破性地实现了纳米金同生物分子间特异性偶联，有效提高其选择性分析能力。以纳米金探针制备为基础，研究探讨了纳米金同血清白蛋白偶联的最佳条件；本研究引入分子仿生学原理模拟生物矿化过程实现了纳米金偶联物的特异性二次生长，建立起基于纳米金共振散射光谱特性的超痕量蛋白分子定量分析方法（已获国家发明专利）。在实现以上原理突破的同时，研发了配套分析软件，进一步简化了检测流程，提高了检测效率，弱化了检测的技术限制，为打破国外垄断，填补高端纳米金检测试剂及相关分析软件的国产化空缺提供必备的实践基础。 本研究有机结合了新型反应体系与高效节能的微波加热法，建立起纳米金探针制备的新工艺。通过此工艺流程制得的纳米金探针，具备高均一性、高分散性及高稳定性。研究进一步引入分子仿生学原理，实现了纳米金共振散射光谱的特异性增强，特征峰值强度提高322倍。以纳米金共振散射增强分子探针为基础建立了超痕量蛋白质（纳克级）的定量检测方法。较之常规分析方法，检出限降低3个数量级，检测范围为3.00×10-9mol/L至2.40×10-8mol/L，检出限低至3.00×10-9mol/L，本研究各项指标达到该领域国内外前沿水平。该方法具有优良的可移植性，为其在科学研究、临床诊断、食品安全和环境监测等方面的应用中实现对超痕量蛋白质可控、稳定、特异、灵敏地分析开辟新思路，也提供必备的理论基础和经验支持。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 研究目的：制备基于分子仿生学原理的纳米金超痕量蛋白检测探针。建立新型蛋白检测方法，并研发配套分析软件。 基本思路：1、利用微波回流法制备表面活性氨基修饰的纳米金溶胶。2、研究纳米金同白蛋白间的微观作用机理，制备生物偶联物。3、模拟生物矿化过程实现偶联物选择性二次生长，特异增强检测目标信号，进而实现超痕量蛋白质的定量检测。4、配合超痕量蛋白检测方法，研发配套分析软件，进一步简化分析操作。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：创新地引入分子仿生原理模拟生物矿化过程，特异性增强纳米金生物偶联物共振散射信号，将生物信息转化为光谱信号，基于光谱分析建立超痕量蛋白检测新方法，构思合理可行。 先进性：优化氨基修饰纳米金制备工艺，成本仅为进口产品1/53。结合仿生学方法和光谱分析技术。检出限低至3nM，检测范围为3nM至24nM。 独特性：交叉综合分子仿生学、光谱学和纳米科学等领域理论技术。该检测方法已申请国家专利。
应用价值和现实意义
- 实际应用价值：基于本研究所得结论，可针对特定用途制备相应纳米金探针，配合分析软件，可实现超痕量蛋白的定量检测。新型蛋白质检测方法可应用于肿瘤早期诊断、混合蛋白体系快速在线分析等领域。 现实意义：本研究建立起一套新型超痕量蛋白质检测方法。为纳米金光学探针在分子信号识别、肿瘤早期诊断、生物芯片、环境监测等应用中实现对超痕量蛋白可控、稳定、特异、灵敏的分析开辟新思路，也提供必备的理论基础和经验支持。
学术论文摘要
- 本文研究基于分子仿生学原理的超痕量蛋白质检测纳米金探针及超痕量蛋白检测方法。以共振散射特征为基础建立高灵敏、高选择性痕量蛋白分子定量检测方法。 首先，利用树状体（PPIHA）结合微波回流法制备表面氨基修饰的纳米金微粒溶胶，并用傅里叶变换红外光谱法分析微粒表面氨基修饰程度。其次，以紫外-可见吸收光谱和共振散射光谱为手段，研究了氨基修饰的纳米金微粒与血清白蛋白表面特异性微观作用机理。在此基础上确定了pH值、反应物比率等因素对纳米金偶联物稳定性的影响，得到偶联物形成的最适条件。以纳米金微粒与白蛋白结合形成纳米金生物探针。在盐酸羟胺-氯金酸体系中，Au3+在偶联物周围富集并在其表面还原。通过该过程增大纳米金偶联物粒径，同时复合物的共振散射光谱得到选择性增强。实验结果表明，生物矿化产物的584nm处的共振散射峰值同偶联物在3nM至24nM范围内具有良好线性关系。而且，该检测方法的检出限为3nM，优于同类其他方法。 本检测方法建立在特异性结合基础上，具有高选择性和高灵敏度，为纳米金探针在超痕量分子识别等方面的应用中实现对超痕量蛋白质可控、稳定、特异、灵敏地开辟新思路，也提供必备的理论基础和经验支持。
获奖情况
- 1、研究成果已申请国家发明专利“一种超痕量蛋白质定量检测方法”（申请号：201110089936.2，第一作者为本科学生）； 2、研究成果以学生第一作者发表英文论文两篇，已分别投稿至Analytica Chimica Acta（SCI数据源期刊，影响因子：3.765,美国）及Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects（SCI数据源期刊，影响因子1.998，美国），目前正在审稿； 3、受邀参加2010年“中国生物医学工程学会成立三十周年纪念大会”，学生第一作者发表论文并就研究成果做学术报告，会上本研究小组成员（本科）入选学会青年会员； 4、该项目受国家大学生创新实验项目专项资助（项目编号：091069830）。成果获“挑战杯”陕西省学术科技竞赛特等奖、“腾飞杯”学术科技竞赛特等奖； 5、该项目得到了中国生物医学领域创始人蒋大宗先生和美国Harward-MIT生物医学联合研究中心徐峰研究员的推荐。
鉴定结果
- 首次将分子仿生学原理应用于生物分子定量分析，制备纳米金生物共振散射探针，应用于超痕量蛋白质定量检测。国内外未见超痕量纳米金共振散射光谱探针、蛋白质检测方法及配套光谱分析软件的研究报道。
参考文献
- 1、科技部国内外科技查新报告，编号：201136000Z08D073； 2、国家发明专利“一种超痕量蛋白质定量检测方法”，申请号：201110089936.2; 3、P. Raveendran, et al., Completely “Green” Synthesis and Stabilization of Metal Nanoparticles[J], J.Am.Chem.Soc., 125(2003)13940; 4、M. Bruchez Jr., et al., Semiconductor Nanocrystals as Fluorescent Biological Labels[J], Science. 281(1998)2013-2016; 5、L. Shang, et al., Enhanced resonance light scattering based on biocatalytic growth of gold nanoparticles for biosensors design[J], Biosens. Bioelectron. 23(2008)1180-1184; 6、L. M. Ao, et al., Interaction between Gold Nanoparticles and Bovine Serum Albumin or Sheep Antirabbit Immunoglobulin G[J], Chin.J.Chem. 24(2006)253-256; 7、K. Esumi, et al., Role of poly(amidoamine) dendrimers for preparing nanoparticles of gold, platinum, and silver[J], Langmuir. 16(2000)2604-2608; 8、H. Li, L. Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles[J], PNAS. 101(2004)14036-14039.
同类课题研究水平概述
- 共振光散射（RLS）光谱法是由Pasternack研究组[1]于二十世纪九十年代提出的一种痕量检测方法，这种光谱检测方法具有好的选择性、高的灵敏度、仪器简单的特点，越来越来引起人们的关注和研究。RLS光谱法提出以来，其在DNA、蛋白质[3-6]等生物大分子的检测与分析因检测限高（纳克级）而获得广泛的应用前景。 根据共振光散射理论，纳米金在500-600nm之间存在与其SPR吸收峰对应的共振散射峰，再加上纳米金颗粒具有良好的生物相容性，利用纳米金构建基于免疫分析的光谱探针近几年取得了一定的进展。董绍俊[7]课题组利用葡萄糖氧化酶分解葡萄糖产生的过氧化氢能促进纳米金生长增强纳米金的共振散射强度的特点，构建用于检测葡萄糖的传感器，线性检测范围为1.0×10-6-1.1×10-4M，检测限为6.8×10-7M。该方法是直接利用纳米金直径增大增强共振光散射强度，不涉及到待检物质与纳米金探针的相互作用。蒋治良[8]等用纳米金标记抗体制备成探针，带检测的物质与探针结合形成复合物，会急剧增强纳米金的共振光散射强度，可以用来检测各种样品。另外，蒋治良[9]等用直径为10nm的纳米金标记羊抗人白蛋白抗体，形成的探针在pH=5的环境下发生聚集，加入白蛋白后离心处理，获得的上清液用于催化亚铜粒子生长，增强的光散射光强度与加入的白蛋白量成线性关系。 本研究基于分子仿生学原理以纳米金共振散射探针为研究对象，建立了超痕量蛋白质检测方法，并研发了配套分析软件系统。以PPIHA为修饰剂通过微波回流法一步制得表面活性氨基修饰的纳米金（AuNPs）溶胶。进而偶联血清白蛋白得到偶联物，通过分析比对偶联前后的共振散射光谱特性，建立起基于分子仿生学原理的超痕量蛋白质检测方法，检出限为3.00×10-9mol/L。以上述理论为核心，研发了配套的超痕量蛋白质分析软件，构建起一套实用高效的分析流程。本研究将为纳米金光学探针及配套分析软件在超痕量分子识别、肿瘤早期诊断、生物芯片、环境监测等方面的应用中实现对超痕量蛋白质可控、稳定、特异、灵敏地开辟新思路，也提供必备的理论基础和实践经验。 注：参考文献详见正文。
