基本信息
- 项目名称：
- 微生物毒素AFB1诱导小鼠肝脏病变过程中相关蛋白功能研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 黄曲霉毒素(Aflatoxins)是黄曲霉(A．flavors)和寄生曲霉(A．parasiticus)等产毒菌种产生的次生代谢产物,其中黄曲霉毒素B1是现在发现的毒性和致癌性最强的天然污染物。
- 详细介绍：
- 黄曲霉毒素(Aflatoxins)是黄曲霉(A．flavors)和寄生曲霉(A．parasiticus)等产毒菌种产生的次生代谢产物,其中黄曲霉毒素B1是现在发现的毒性和致癌性最强的天然污染物。本研究通过蛋白质组学、生物信息学、分子生物学等多种实验手段结合起来研究黄曲霉毒素B1诱导表达的肝脏蛋白的功能。研究用黄曲霉毒素B1，处理小白鼠和细胞， 结果发现AFB1不仅会造成小白鼠发病 ，也会造成细胞不同程度上的损伤。运用双向电泳找出小鼠发病后肝脏的差异蛋白质，经质谱分析得到蛋白的氨基酸序列，用生物信息学软件分析预测其结构及功能，结果发现30个蛋白质点变化差异显著。分析其中7个明显上调和下调的蛋白质点,其中有4个蛋白可能属于引发小鼠肝脏发生病变或癌变的蛋白质点，另外3个蛋白可能参与小鼠肝脏能量与物质的代谢。结果表明，这些蛋白对小鼠肝脏都有着很大的影响 。 选取其中与肿瘤关系较大基因atp5b进行研究，利用荧光定量PCR技术分析atp5b在免疫小鼠肝脏中的动态变化情况，结果与双向电泳的结果基本一致。为了进一步研究atp5b的细胞生物学功能，本研究构建过表达载体pCDNA3.1(-)-atp5b、RNA干扰载体pGPU6/GFP/neo-shRNA，通过脂质体转染到哺乳动物细胞中，G418筛选获得稳定表达细胞株。研究发现，AFB1处理会引起细胞中atp5b含量的降低；而在atp5b过表达的体系中，在缺氧条件下，细胞增殖率变小，生长缓慢；在atp5b干扰的细胞系中，MTT法检测细胞增殖能力，发现设计的3个shRNA片段中shRNA1、shRNA2组细胞增殖率大于1，shRNA3组细胞增殖率小于1；干扰apt5b后细胞耐受AFB1的能力降低。本研究进一步验证了atp5b对细胞生物学行为的影响，也将为阐明肿瘤细胞中ATP合成酶的功能提供了理论依据。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 黄曲霉毒素，是现在发现的毒性和致癌性最强的天然污染物。目前国内外在黄曲霉毒素致毒机理方面的研究大都缺乏系统性，这对深入全面地了解黄曲霉毒素的毒理作用，对其诱发的肿瘤进行标本兼治很不利的。本研究通过比较正常和病理情况下蛋白质在肝脏中表达差异，能够同时发现与病理改变有关的一系列疾病特异性蛋白质，并通过蛋白质组学、生物信息学、分子生物学等多种实验手段结合起来研究黄曲霉毒素诱导的小鼠肝脏相关蛋白的功能。
科学性、先进性及独特之处
- 本研究以昆明鼠作为模式动物，大大降低了试验成本，同时结合多种试验方法研究黄曲霉毒素诱导的小鼠肝脏蛋白的功能。将为今后生物毒素研究搭建了一个较理想的平台 。
应用价值和现实意义
- 本研究从感染老鼠开始到定位特异蛋白在经典发病途径中的作用，是国内外首次系统的对污染农产品的黄曲霉毒素的致毒机理进行研究。 本研究将为系统地揭示黄曲霉毒素诱导疾病的发生机制铺平道路，为完善疾病的发生通路提供有益信息，为疾病的诊断提供新的分子标记，同时为肝癌的治疗和药物开发提供了一些新的思路。
学术论文摘要
- 本研究用黄曲霉毒素B1，处理小白鼠和细胞，发现AFB1会造成小白鼠发病，同时会造成细胞不同程度上的损伤。然后运用双向电泳找出小鼠发病后肝脏的差异蛋白质，经质谱分析得到蛋白的氨基酸序列，用生物信息学软件分析预测其结构及功能。结果发现30个蛋白质点变化差异显著，分析其中7个明显上调和下调的蛋白质点。其中有4个蛋白可能属于引发小鼠肝脏发生病变或癌变的蛋白质点，另外3个蛋白可能参与小鼠肝脏能量与物质的代谢。这些蛋白对小鼠肝脏都有着莫大的影响。 本研究选取其中与肿瘤关系较大基因atp5b进行研究，先利用荧光定量PCR分析其在免疫小鼠肝脏中的动态变化情况，结果与双向电泳的结果基本一致。然后构建过表达载体和RNA干扰载体，通过脂质体转染到哺乳动物细胞中，用以研究atp5b的细胞生物学功能。研究发现，AFB1处理会引起细胞中atp5b含量的降低；在atp5b过表达的体系中，缺氧条件下，细胞增殖率变小，生长缓慢；在atp5b干扰的细胞系中，MTT法检测细胞增殖能力，发现设计的3个shRNA片段中shRNA1、shRNA2组细胞增殖率大于1，shRNA3组细胞增殖率小于1。本研究进一步验证了atp5b对细胞生物学行为的影响，也将进一步阐明在肿瘤细胞中ATP合成酶的功能提供了条件。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] 苏建家, 李瑗, 班克臣, 等. 动态研究HBV和AFB1诱发树鼩肝细胞癌过程中一些基因的表达[J]. 广西医科大学学报, 2001, 18(2): 15l-154. [2] J. Sambrook，E．F．Fritsch，T．Maniatis著．分子克隆实验指南[M]．金冬雁，黎孟枫译．第二版．北京：科学出版社，1996：19-55 [3]Okazaki S, Naganuma A, Kuge S. Peroxiredoxin-mediated redox regulation of the nuclear localization of Yap1 a transcription factor in budding yeast. Antioxid Redox Signal, 2005, 7 (324):327-333
同类课题研究水平概述
- 在天然污染的粮食中以黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大，量也最多，致癌性也最强，它属于肝脏毒素，能诱发肝癌。虽然AFB1的致癌机制由于缺乏直接的证据而一直不能充分肯定，但是许多相关研究表明黄曲霉毒素，特别是AFB1于肝癌的发生确实有莫大的关系。研究显示，AFB1进入体内后由于具有亲肝性首先在肝细胞内聚积，随后在细胞色素P450系统作用下转变为8,9-环氧AFB1 (AFB1-8,9-epoxide，AFBO)，催化这一代谢的关键酶为细胞色素P450，该酶正好主要存在于肝细胞内。在P450 3A4作用下的形成exo-AFBO为人类所知的具有基因毒性和致癌性的AFB1代谢产物。AFB1的基因毒性之一是诱发DNA损伤和导致基因突变。AFBO能和DNA分子共价结合形成AFB1-DNA，这一加合物的形成是其发挥基因毒性的关键步骤。目前关于黄曲霉毒素致癌的分子机制已经有了一个大概的轮廓，但在其致癌过程中所涉及的具体效应分子还不是很清楚。秦雪等人用双向电泳等技术建立树鼩肝癌实验模型，并对PrxⅡ蛋白的差异表达进行了验证，证实该蛋白在肝癌组织中的蛋白表达及基因表达水平均较癌前组织明显上调。Domenico C等在其研究中应用组织芯片技术检测到骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)高度表达于多种恶性肿瘤细胞质，其表达与这些肿瘤的病理分级存在密切联系表明，OPN在肿瘤演进中发挥了重要作用。肝癌的发生和发展是多因素、多基因参与的病理过程其机制错综复杂，如何评价某种蛋白在该病理过程中所起的作用还需进一步验证。
