基本信息
- 项目名称：
- 人骨形态发生蛋白4成熟肽序列在毕赤酵母中的高效表达、纯化和活性检测
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 根据毕赤酵母高表达基因对特定密码子偏好的特性，选择毕赤酵母高表达基因偏好的密码子，替换人BMP-4成熟肽序列在毕赤酵母高表达基因中不常用的密码子，优化设计人BMP-4成熟肽表达序列并构建重组表达载体；转化毕赤酵母宿主菌和筛选高表达菌株；利用色谱纯化技术设计纯化路线，纯化重组人BMP-4；对纯化的重组蛋白进行生理活性检测。
- 详细介绍：
- 目的：骨形态发生蛋白4（Bone morphogenetic protein 4，BMP4）是一种生长因子，具有明显促进细胞组织分化为骨组织的能力，在骨缺损、骨折的修复和脊柱融合等众多方面的骨科临床上有很高的应用价值。从哺乳动物骨骼材料中提取的天然BMP-4数量有限、成本高、且具有免疫源性，限制了其在临床上的应用。为此，我们建立了人BMP-4在毕赤酵母中的高效表达及纯化工艺。 方...(查看更多)
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 天然提取的BMP-4数量有限、成本高、且具有免疫源性，限制了其在临床上的应用。为此，我们建立了人BMP-4在毕赤酵母中的高效表达及纯化工艺。选择毕赤酵母高表达基因偏好的密码子，替换人BMP-4成熟肽序列在毕赤酵母高表达基因中不常用的密码子，优化设计人BMP-4成熟肽表达序列并构建重组表达载体；转化毕赤酵母宿主菌和筛选高表达菌株；纯化重组人BMP-4；对纯化的重组蛋白进行生理活性测。
科学性、先进性及独特之处
- 利用毕赤酵母使用的高频密码子替换hBMP-4成熟肽序列中的低频密码子并控制其序列的A+T含量在30-55%水平，人工设计一条hBMP-4成熟肽优化序列。优化序列通过人工合成并在毕赤酵母中实现高效表达。与原序列相比，密码子优化后序列使hBMP-4的表达产量提高了4倍，通过色谱法纯化hBMP-4，建立了纯化工艺。而纯化后hBMP-4显示出可诱导软骨细胞的形成和增加碱性磷酸酶的生物活性。
应用价值和现实意义
- BMPs是一类广谱性的蛋白质生长调节因子，在临床医学有很好应用前景。但是天然提取的BMPs产量低，费用高，无法很好的应用在临床医学上。本研究通过优化密码子的手段，使hBMP-4在毕赤酵母中表达产量提高了4倍，且通过色谱层析法纯化得到BMP-4并对纯化后的hBMP-4的生理活性进行鉴定，从而得到高表达，纯化的，有活性的BMP-4。为进一步开展临床应用的研究和将来可能的临床应用奠定了研究基础。
学术论文摘要
- 在最初的表达研究中，我们将原始的hBMP-4成熟肽序列在毕赤酵母中表达。尽管hBMP-4在非常强的酵母启动子AOX1控制下表达，但其在摇瓶培养中表达量较低。为了提高hBMP-4的表达水平，我们利用酵母高表达基因使用的高频密码子替换了hBMP-4原序列中低频密码子，设计一条表达序列。该序列只含有酵母偏好的密码子，同时A+T含量被控制在30-55%的范围内。密码子优化后使hBMP-4...(查看更多)
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Shore EM, Xu M, Shah PB, Janoff HB, Hahn GV, Deardorff MA, Sovinsky L, Spinner NB, Zasloff MA, Wozney JM, Kaplan FS. The human bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) gene: molecular structu...(查看更多)
同类课题研究水平概述
- 骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)，是一类广谱性的蛋白质生长调节因子，其全长cDNA约为1.2 kb，转录、翻译后具有生理活性的分子是一类磷酸化的二聚体糖蛋白多肽分子。已有的研究表明BMPs不仅对器官的发育起关键的作用，而且对骨质的生长、神经细胞的再生、创口愈合以及神经肿瘤的治疗等均有明显的促进功能。 国内研究机构多利用原核系统表达...(查看更多)
