基本信息
- 项目名称：
- 人血管内皮细胞生长抑制因子（VEGI）的结构与功能学初步研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本课题探讨血管内皮生长抑制因子（VEGI-192）的结构和功能学关系，首次发现VEGI-192蛋白具有形成多聚体空间结构的特性；通过体内、体外抗血管新生实验，证明了VEGI-192蛋白多聚体的结构形式可能为其生物学活性形式；同时以整合素αvβ3为肿瘤靶点，RGD-4C肽为肿瘤靶向载体，VEGI-192蛋白为抗肿瘤效应分子，成功构建靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-VEGI-192。
- 详细介绍：
- 本课题组成员自2008年开始研究一种更加高效稳定的蛋白表达系统和纯化复性方法，目前已成功建立VEGI-192蛋白的新型自动诱导原核表达系统及蛋白制备新工艺，并能高效稳定地表达高产量、高纯度、高活性及可溶性好的VEGI-192重组蛋白。因为本系统自身的独特设计，可以为重组蛋白在宿主菌中提供均衡氧化还原势能，以利于蛋白的正确空间折叠，应用该自动诱导系统表达的VEGI-192重组蛋白在产量、可溶性、活性等方面均明显优于传统IPTG诱导表达系统。而在蛋白纯化过程中，通过Western blotting检测方法比较两个系统获得的VEGI-192重组蛋白条带的异同，我们发现自诱导系统存在的丰富的多聚体形态，于是，我们提出一个假设：VEGI-192蛋白具有形成多聚体空间结构的特性，并且研究证明这种多聚体的结构形式可能为其生物学活性形式。 我们发现，进行非还原SDS-PAGE后再进行Western Blotting检测来进一步分析鉴定自诱导表达系统纯化的VEGI-192蛋白，有两条蛋白条带清晰可见，我们推测这很可能便是VEGI-192的多聚体条带。为了进一步验证排除非特异条带的可能性，我们充分煮沸使VEGI-192变性后再次进行Western Blotting分析，结果显示无多聚体蛋白条带，这从一方面面证明了VEGI-192存在多聚体的结构形式。同时，我们将VEGI-192用非还原SDS-PAGE后再进行考马斯亮蓝染色，切下处于上方的多聚体条带作质谱分析，结果显示该条带即为VEGI-192蛋白，这充分证明了VEGI-192存在多聚体的结构形式。目前我们正开展对VEGI-192蛋白的结晶实验，拟进行X-射线晶体衍射实验对其多聚体结构进行更为详尽的鉴定。 我们发现了自诱导系统制备的重组蛋白的多聚体量更多，进而通过采用MTT比色试验法和Annexin V细胞染色分析结合流式细胞术检测VEGI-192重组蛋白在不同多聚体形态下的体外抑制内皮细胞增殖及诱导细胞凋亡的生物学活性。同时应用鸡胚绒毛尿囊血管新生抑制实验测定两者体内抑制血管新生活性，我们发现多聚体含量越高的VEGI-192重组蛋白其抗血管新生的生物学活性更强。这充分证明VEGI-192蛋白形成的多聚体的空间结构可能为其生物学活性形式。 同时在VEGI-192蛋白的结构改造与修饰方面，我们引入RGD多肽与VEGI-192形成嵌合蛋白，拟探讨RGD的嵌合改造是否能增强VEGI-192的功效。RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，作为整合素和其配体相互作用的识别位点, 介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用。肿瘤细胞或者新生血管可以特异表达某些整合素如αvβ3，能以一定的亲和力结合RGD肽,成为肿瘤治疗的新靶点。因此,RGD 肽在肿瘤治疗中的应用已成为研究热点。RGD肽可以诱导肿瘤细胞凋亡而且作为载体在肿瘤靶向治疗中发挥重要作用。而目前在VEGI蛋白的三维立体结构、作用机理和药理学性质没有完整清晰的了解的情况下，我们拟构建靶向性更强的嵌合重组蛋白RGD-VEGI-192，以整合素αvβ3为肿瘤靶点，RGD-4C肽为肿瘤靶向载体，VEGI-192蛋白为抗肿瘤效应分子，构建靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-VEGI-192，并检测其生物学活性，为深入探讨RGD-VEGI-192的体内靶向抑瘤活性及肿瘤治疗应用前景奠定基础。同时丰富了VEGI-192在肿瘤治疗中的应用形式，为肿瘤靶向治疗提供了新思路。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 血管内皮生长抑制因子（VEGI）是一种新型高效的内源性血管新生拮抗剂，本课题通过研究血管内皮生长抑制因子新亚型（VEGI-192）的三维空间结构和功能学关系；同时进行VEGI-192基因结构修饰改造，以获得抗血管新生活性更好的VEGI-192重组蛋白RGD-VEGI-192，为其作为临床药物开发打下基础。
科学性、先进性及独特之处
- 本课题首次发现VEGI-192蛋白具有形成多聚体空间结构的特性，并且研究证明这种多聚体的结构形式可能为其生物学活性形式。同时首次以整合素αvβ3为肿瘤靶点，RGD-4C肽为肿瘤靶向载体，VEGI-192蛋白为抗肿瘤效应分子，成功构建靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-VEGI-192。目前着眼于两个领域已进行专利申请以及论文发表。
应用价值和现实意义
- VEGI是一种新型血管新生抑制剂。研究表明其对多种肿瘤均有抑制效果，且毒副作用低，有巨大的临床应用前景。其与目前临床使用的thalidomidle，avastin和cartcell抗肿瘤原理相似。而本研究为其制剂推向新药临床试验打下基础。即使在临床早期，单药治疗疗效未能充分确立时，因其抗肿瘤机制与传统的放化疗相异，与多种传统方案联合使用有望观察到协同作用。故本研究有望创造巨大的经济和社会价值。
学术论文摘要
- 目的：探讨血管内皮生长抑制因子（VEGI-192）结构和功能学关系，通过基因改造获得抗血管新生活性更高的RGD-VEGI-192蛋白。 方法：采用非还原SDS-PAGE，Western blotting及质谱技术验证VEGI-192多聚体的存在。MTT比色法和Annexin V细胞染色分析结合流式细胞术检测VEGI-192不同多聚体形态下体外抑制内皮细胞增殖及诱导凋亡的活性。应用鸡胚绒毛尿囊血管新生抑制实验测定两者体内抑制血管新生的活性。PCR扩增RGD-VEGI-192融合基因并获得RGD-VEGI-192蛋白，鉴定其体外抗血管新生活性。 结果：Western blotting及质谱技术验证了VEGI-192的多聚体形态，MTT比色法和Annexin V细胞染色分析证明多聚体数量与其抑制内皮细胞增殖及诱导凋亡功效成正相关。成功构建RGD-VEGI-192融合基因并获得RGD-VEGI-192蛋白，证明其活性高于VEGI-192。 结论：首次发现VEGI-192具有多聚体结构，并证明多聚体可能为其生物学活性形式。通过首创性基因修饰改造获得活性更高的RGD-VEGI-192。
获奖情况
- 1.本论文部分结果已发表于SCI杂志《Protein Science》，影响因子2.9，本课题组成员刘汉凝同学为共同第一作者。 2.本课题组构建的VEGI-192蛋白的新型自动诱导原核表达系统及蛋白制备新工艺的专利申请已获国家知识产权局予以受理，申请号为200910037702.6。 3.本课题组构建的靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-VEGI-192表达克隆专利申请已获国家知识产权局予以受理，申请号为200910037701.1。 4.本作品获我校第十一届“挑战杯”大学生课外学术作品大赛一等奖。 5.本作品获广东省第十一届“挑战杯”大学生课外学术作品大赛特等奖。
鉴定结果
- 该作品系学生课外学术科技作品，符合要求。
参考文献
- [1] Holleb AI, Folkman J.Tumor angiogenesis. CA-Cancer-J-Clin, 1972, 22(4): 226-9 [2] Oku Naoto, Asai Tomohiro, Watanabe Koh, et al.Anti-neovascular therapy using novel peptides homing to angiogenic vessels. Oncogene, 2002, 21(17): 2662-9 [3] [4] Zhai Y, Yu j, Iruela Al, Huang WQ, et al. Inhibition of angiogenesis and breast cancer xenograft tumor growth by VEGI, a novel cytokine of the TNF superfamily . Int J Cancer 1999;82:131-6 [5] Zhai et al, A novel cytokine of the tumor necrosis factor family ,is an angiogenesis inhibitor that suppresses the growth of colon carcinomas in vivo. FASEB J 1999;13:181-9 [6] Hou W, Medynske D, Wu S, Lin X, Li LY. VEGI-192, a New Isoform of TNFSF15, Specifically Eliminates Tumor Vascular Endothelial Cell and Suppresses Tumor Growth . Clin Cancer Res 2005,11(5):5595-5602
同类课题研究水平概述
- 血管内皮生长抑制因子（VEGI）是新发现的血管新生拮抗剂，属肿瘤坏死因子超家族，Ⅱ型跨膜糖蛋白。人VEGI基因以不同的剪接方式形成三种异构体：VEGI-174、VEGI-192和VEGI-251。研究发现VEGI-192显著抑制牛动脉内皮细胞与人脐静脉内皮细胞的增殖，在三种拼接异构体中最高，对人冠状动脉平滑肌细胞及鼠路易士肺癌细胞等无抑制增殖作用。VEGI-192还能抑制内皮细胞形成管状结构。体内实验显示，系统性腹腔注射VEGI-192有效抑制异体移植肿瘤生长，肿瘤血管化程度显著降低，且显示无肝肾毒性。研究发现VEGI对不同的肿瘤模型如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等都具有显著的抗肿瘤疗效。 研究发现VEGI的作用机制包括：（1）对不同细胞周期的血管内皮细胞的作用：VEGI使G0/G1期内皮细胞生长停滞；对增殖期的内皮细胞则诱导其凋亡。（2）调节免疫。VEGI全身给药后，各种细胞因子血浓度明显上调，脾内淋巴细胞数量增加，骨髓造血祖细胞动员。体外培养可激活NK细胞和树突状细胞。（3）影响血管形成。此方面影响正在研究中。（4）受体（或配体）及作用的信号转导通路。受体不明，研究显示VEGI-251可与肿瘤坏死因子受体家族中的死亡受体3(death receptor 3，DR3)或诱骗受体3(decoy receptor 3，DcR3)结合而启动不同的信号转导通路。 VEGI基因发现至今，其分子受体、蛋白三维结构注释及作为抗肿瘤制剂临床前研究方面一直停滞不前，根本原因为其纯化制备所得蛋白往往形成沉淀。这主要因为该蛋白：（1）含两个半胱氨酸，推测其正确折叠需二硫键形成。（2）等电点为7.8，非常接近人的生理pH及常规中性缓冲溶剂，易在溶剂中聚集沉淀。（3）为Ⅱ型跨膜糖蛋白，疏水性大，体外表达纯化技术一直有待改善。以往研究制备的VEGI产量、可溶性和活性均不理想，极大地限制了其结构生物学研究和临床应用。 RGD肽是1984年由Pierschbacher和Ruoslahti发现的一类含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，存在于多种生物体的各种组织中，作为整合素和其配体相互作用的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用。肿瘤细胞或新生血管可特异表达某些整合素如αvβ3，以一定亲和力结合RGD肽，成为肿瘤治疗的新靶点。
