基本信息
- 项目名称：
- 石斑鱼抗菌肽的分离纯化及其活性分析
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 利用致病性哈氏弧菌经腹腔注射对布氏石斑鱼进行诱导刺激，其头肾粗提物具有较好的抑菌活性。利用电泳凝胶琼脂糖弥散法检测发现，头肾粗提物中含有多种对大肠杆菌D31有较强抑制作用的蛋白类抗菌物质；切胶回收AU-PAGE凝胶上的抗菌组分，利用SDS-PAGE凝胶检测各抗菌活性组分的分子量，利用491制备型电泳槽对布氏石斑鱼头肾粗提物进行分离纯化。
- 详细介绍：
- 石斑鱼是海南水产养殖的主要对象，随着养殖规模扩大，养殖病害日益严重。抗生素有耐药性，药物残留等缺点，因此选择对抗菌肽的研究来提高养殖质量。而石斑鱼抗菌肽的分离纯化研究较少，主要集中在基因克隆方面的研究，因此我们选择布氏石斑鱼作为研究对象。利用致病性哈氏弧菌（Vibrio harveyi）经腹腔注射对布氏石斑鱼（Epinephelus bleekeri）进行诱导刺激18h，其头肾粗提物具有较好的抑菌活性，不仅可抑制金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等革兰氏阳性菌，也可抑制大肠杆菌D31（Escherichia coli D31）、哈氏弧菌和溶藻弧菌(V. alginolyticus)等革兰氏阴性菌；利用电泳凝胶琼脂糖弥散法检测发现，头肾粗提物中含有多种对大肠杆菌D31有较强抑制作用的蛋白类抗菌物质；切胶回收AU-PAGE凝胶上的抗菌组分，利用SDS-PAGE凝胶检测各抗菌活性组分的分子量大小依次约为10.9KD、10.0KD、8.1KD、7.2KD、6.3KD，利用491制备型电泳槽对布氏石斑鱼头肾粗提物进行分离纯化，其效果要优于一般使用的层析法分离抗菌肽的方法，为为今后利用高压液相色谱进行分离纯化奠定了良好的基础。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 撰写目的：本作品选取海南经济养殖品种布氏石斑鱼作为研究对象，旨在从头肾分离得到新型抗菌肽，为后期新型药物开发，控制病害提供依据。 基本思路：从布氏石斑鱼头肾分离得到粗提物，进行抗菌活性检测及活性物质性质分析，确定为蛋白类活性物质后，通过AU-PAGE电泳和SDS-PAGE电泳进行纯化和分子量测定；同时粗提物进行491制备型电泳槽分离纯化的探索，希望为今后抗菌肽的提取提供新的方法。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：实验设计过程参考并总结了大量国内外相关文献，实验步骤相互验证。先进性：石斑鱼是我国南方重要的经济养殖品种。但有关其抗菌肽等抗菌蛋白类物质的研究并不多。大部分石斑鱼抗菌肽的研究都集中在基因克隆方面，特别是布氏石斑鱼在分离提取方面的研究少有报道。独特之处：在抗菌肽的分离中，使用491制备型电泳槽进行抗菌肽的分离提纯，比传统使用的层析法效果更好，目前在国内使用此方法的并不多。
应用价值和现实意义
- 抗菌肽是被认为是最有可能替代现有抗生素用于疾病防治的新型抗菌药物。在水产养殖动物病害防治方面具有巨大的应用前景。本研究结果不仅有助于揭示石斑鱼的免疫机制，为控制其病害探索合适方法，还有助于从石斑鱼中发现具有较强活性的新型抗菌肽类，扩展整个鱼类抗菌肽的研究深度和广度，从而为研究具有良好活性且具有开发应用前景的病害控制新药奠定基础，并推动具有自主知识产权的新型抗感染药物和水产养殖业的可持续发展。
学术论文摘要
- 利用致病性哈氏弧菌（Vibrio harveyi）经腹腔注射对布氏石斑鱼（Epinephelus bleekeri）进行诱导刺激18h，其头肾粗提物具有较好的抑菌活性，不仅可抑制金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等革兰氏阳性菌，也可抑制大肠杆菌D31（Escherichia coli D31）、哈氏弧菌和溶藻弧菌(V. alginolyticus)等革兰氏阴性菌；利用电泳凝胶琼脂糖弥散法检测发现，头肾粗提物中含有多种对大肠杆菌D31有较强抑制作用的蛋白类抗菌物质；切胶回收AU-PAGE凝胶上的抗菌组分，利用SDS-PAGE凝胶检测各抗菌活性组分的分子量大小依次约为10.9KD、10.0KD、8.1KD、7.2KD、6.3KD，利用491制备型电泳槽对布氏石斑鱼头肾粗提物进行分离纯化，未达到很好的分离效果，其分离条件尚需进一步优化。
获奖情况
- 省级“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛二等奖
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] OREN Z, SHAI Y. A class of highly potent antibacterial peptides derived from pardaxin, a pore-forming peptide isolated from Moses sole fish Pardachirus marmoratus [J]. European Journal of Biochemisty, 1996, 237:303~310. [2] PAN C Y, CHEN J Y, NI I H. et al. Organization and promoter analysis of the grouper (Epinephelus coioides) epinecidin-1 gene [J]. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B,2008,150: 358–367. [3] VEGA E, O’LEARY N A, SHOCKEY J E, et al. Anti-lipopolysaccharide factor in Litopenaeus vannamei (LvALF): A broad spectrum antimicrobial peptide essential for shrimp immunity against bacterial and fungal infection [J]. Molecular Immunology, 2008,45:1916-1925.. [4] SILPHADUANG U, NOGA E J. 2001. Antimicrobials: Peptide antibiotics in mast cells of fish [J]. Nature, 414: 268-269. [5] PANYIM S, CHALKLEY R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histone [J]. Archives of Biochemisty and Biophysics,1969,130:337.
同类课题研究水平概述
- 自上世纪八、九十年代以来，相关人员主要采用分离纯化和测序的模式得到了约20多种的鱼类抗菌肽，主要有泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）的misgurin，美洲拟鳎（Pleuronecte americanus）的piscidins和Bass hepcidin，豹鳎（Pardachirus marmoratus）的pardaxins，斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）的HbβP，鲤鱼（Cyprimus carpio）的糖基化抗菌肽等(Park et al,1997; Cole et al,1997; Lemaitre et al,1996; Oren et al,1996)。随着分子生物学技术的不断成熟，研究人员采用分子生物学的技术手段进行鱼类抗菌肽的基因克隆相关研究，至今已从几十种鱼类克隆到相当丰富的抗菌肽同源基因。斑点叉尾鮰（I. punctatus）的NK-lysin，真鲷（Chrysophrys major）、南极鱼（Dissostichus mawsoni）等多种鱼类的hepcidin，斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）的epinecidin-1等(Chen et al. 2005; Wang et al,2006; Yin et al. 2006; Xu et al. 2008)。目前广泛采用的包括cDNA末端快速扩增（RACE）技术、cDNA文库构建和EST序列测定等分子生物学技术在对鱼类各种同源基因的鉴定方面有着非常大的作用，但对新型鱼类抗菌肽的鉴定仍有点力不从心。所以对于新型鱼类抗菌肽还必须采用传统的分离纯化和测序模式来进行。抗菌肽的分离纯化，目前常用的是先用层析系统初分，再用高压液相色谱（HPLC）进一步纯化，但用层析系统存在一个显著缺陷，即容易丢失含量较少和分子量较小的成分，而这类抗菌肽往往活性高、易合成，开发潜力大。美国北卡州立大学Noga教授实验室对层析系统和491制备型电泳槽分离抗菌肽效果的比较研究表明，后者能更好地保存样品中的活性成分，可有效避免活性成分丢失的问题，更容易分离获得鱼类的新型抗菌肽。本文即采用该方法对石斑鱼的抗菌肽进行分离纯化，期望从石斑鱼中发现具有较强活性的新型抗菌肽类，为研究具有良好活性且具有开发应用前景的病害控制新药奠定基础，具有重要的理论和实际意义。
