基本信息
- 项目名称：
- 重组农杆菌质粒快速鉴定方法
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 科技发明制作A类
- 简介：
- 目的：根据碱裂解法抽提质粒DNA的原理，经过反复实验摸索获得一种快速、稳定、经济的重组子鉴定方法。 方法：本研究通过溶菌酶和煮沸法结合的方法提取重组农杆菌的质粒利用琼脂糖凝胶电泳鉴别重组子，再通过PCR扩增反应鉴定结果。 结论:经实验证明溶菌酶和煮沸法相结合的方法是筛选农杆菌重组子的一种简单易行、经济方便、快速稳定、提高工作效率的方法，其灵敏性和重复性较好,适合在常规实验室推广。
- 详细介绍：
- 实验方法： 1.分别挑取转化到农杆菌中的单菌落，以及未经转化的空质粒作为对照，分别接种于3ml的含有抗生素的LB培养液中，26.5℃，160r/min，培养12-16h，培养至OD600为1.0-1.2。 2.1.2ml菌液加入到1.5ml Eppendoff管中。 3. 4℃，12000r/min，离心1-2min，弃上清，收集菌体。 4.弃去上清液，用无菌滤纸吸干菌体的残留液体。 5. 取10ul溶液I，用移液器反复抽吸混匀，并用涡轮混合仪充分混匀。 6.加入5ul溶菌酶，用移液器充分混匀。 7. 室温放置3min。 8.放入沸水中1min后取出。 9. 4℃，12000r/min，离心10min。 10.取出10ul上清液点样，0.8%琼脂糖凝胶电泳100v 40min后观察结果，对重组质粒和空质粒进行区分。 11. 重组子得PCR鉴定 对重组质粒进行PCR检测，准确地鉴别阳性克隆。
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作品专业信息
设计、发明的目的和基本思路、创新点、技术关键和主要技术指标
- 目的：根据碱裂解法抽提质粒DNA的原理，经过反复实验摸索获得一种快速、稳定、经济的重组子鉴定方法。 基本思路：本研究通过溶菌酶和煮沸法相结合的方法提取重组农杆菌的质粒利用琼脂糖凝胶电泳鉴别重组子，再通过PCR扩增反应鉴定结果。 创新点:将溶菌酶和煮沸法相结合快速稳定的鉴别农杆菌重组子。 技术关键：在本研究中，通过多次实验的经验，以及碱裂解法与煮沸法的启发，经过实验摸索创造出一种快速、方便和经济的重组农杆菌质粒鉴定方法。 主要技术指标：该法只需要在极短时间内提取出质粒，进行琼脂糖凝胶电泳分析，可以初步快速的筛选出重组子，再进行PCR扩增鉴定，准确鉴定阳性克隆，极大地提高了筛选克隆的工作效率。而且经过多次实验，在不同的宿主间比较该方法稳定、方便。
科学性、先进性
- 在分子克隆和以农杆菌为介导进行植物遗传转化研究中重组农杆菌的质粒提取和纯度鉴定是一项常规的实验操作，质粒是否转化成功对后续实验有着重要影响经典的提取质粒DNA的方法主要包括煮沸裂解法、SDS碱裂解法以及氯化铯密度梯度离心等。比较常用的质粒DNA提取方法主要包括碱裂解法、Mini质粒提取等。基于农杆菌细胞的特殊性,一般在提取时需要加入一定量的裂解酶,并在提取后需要用酚、氯仿等进行纯化处理。这些方法尽管具有纯度较高的优点,但操作过程较复杂繁琐,且所使用的药品多对操作人员有直接或间接的危害。虽然有的实验室改进过很多质粒快速提取的方法，但是过程繁琐，需要的试剂也很多，有部分试剂危害性较大。本研究结合了溶菌酶和煮沸法提取的优点,简化操作流程和严格反应环境条件,使农杆菌质粒DNA的提取量及纯度得到了大幅度提高, 缩短操作时间,并且由于操作过程中避免使用酚、氯仿等对人体有害的试剂,使实验本身对操作者的危害得以降低。应用本方法为开展一般的分子生物学研究奠定了基础。
获奖情况及鉴定结果
- 2011年4月15日根据专利法第28条及其实施细则第38条、第39条的规定，申请人提出的专利申请已由国家知识产权局受理。 申报号： 201110094634.4 申报日期 2011年04月15日
作品所处阶段
- 实验室阶段
技术转让方式
- 专利
作品可展示的形式
- 图片
使用说明,技术特点和优势,适应范围,推广前景的技术性说明,市场分析,经济效益预测
- 本研究结合了溶菌酶和煮沸法提取的优点,简化操作流程和严格反应环境条件,使农杆菌质粒DNA的提取量及纯度得到了大幅度提高, 缩短操作时间,并且由于操作过程中避免使用酚、氯仿等对人体有害的试剂,使实验本身对操作者的危害得以降低。本方法可以在常规实验室中广泛使用。
同类课题研究水平概述
- 国外报道过Sambrook J,Russell DW利用煮沸裂解法、SDS碱裂解法以及氯化铯密度梯度离心等方法对质粒的提取的进行不同程度的改进，但是都面临耗时较长，所用危险试剂较多，且很昂贵的问题[1]。 国内有相关报道，中国农业科学院生物技术研究所基因工程实验室的崔洪志、郭三堆，湖北师范学院生命科学学院的王友如等利用常规碱裂解与Mini质粒提取相结合的方法，加大菌液使用量，利用LiCl 离心沉淀DNA，严格限制反应的环境条件，使操作流程简化，并去除了酚、氯仿等有害试剂[2]，但使用的LiCl 价格昂贵，代价高；新乡学院的丰贵鹏、彭芳对农杆菌质粒提取进行了不通过因素的比较分析，采用碱裂解法Mini提取法相结合，并增加了酚氯仿抽提的次数，虽然结果上有所提高，但是增加例如化学试剂的使用次数，危险性较大[3]；福建农林大学作物科学学院单世华、李春娟、张君诚等以农杆菌菌株LBA4404(A•tumefaciens)为载体，以双价表达载体pCGⅡ为研究对象，运用碱裂解法和Mini 质粒提取的优点，提高提取试剂的纯度、增加菌液收集量，通过把简化操作流程与严格限制反应的环境条件相结合，使农杆菌质粒DNA 的提取量大幅增加[4]，但该方法在提取的过程中复性和离心纯化等步骤用时过长。 [1] Sambrook J,Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rded. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, pp.26-66. [2] 王友如，崔洪志，郭三堆．农杆菌质粒DNA提取方法的优化[J]．生物技术，2005，15(4)：41-43． [3] 丰贵鹏，彭芳. 农杆菌质粒DNA高效提取方法研究[J].新乡学院学报，2010, 27(2): 48-51. [4] 单世华，李春娟，张君诚，等．农杆菌质粒DNA提取方法的改良与鉴定[J]．生物技术，2003，13(2)：19-20．
