基本信息
- 项目名称：
- 胭脂鱼低氧诱导因子(HIF-αs)的分子克隆和表达分析及其多态微卫星的分离
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 获得了胭脂鱼的三个低氧诱导因子亚基，并且对其组织表达，胚胎发育不同时期的表达以及低氧-复氧处理的表达进行了分析，构建了胭脂鱼的微卫星文库，开发了一系列引物。
- 详细介绍：
- 中国胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）是长江特有的一种濒危的淡水鱼。低氧诱导因子（HIFs）是一种转录因子，本研究中分离了胭脂鱼的三个亚基HIF-1α, HIF-2α和HIF-3α的cDNA全长，其cDNA全长分别是3890 bp、3230 bp和3374 bp，分别编码780、782和632个氨基酸。通过实时荧光定量来分析三个亚基在不同组织和不同的胚胎发育时期的表达量变化。短期低氧处理实验（2.2, 2.8和3.2 mg/L的溶氧分别处理24小时）增加了HIF-1α和HIF-3α的mRNA表达水平，并且随着氧浓度的降低表达量会增加。在所有处理的条件下HIF-2α的表达水平都远远低于另外两个亚基。本研究也首先使用包含重要的低氧降解结构域ODD结构域的一个区域来区分鲤科鱼类中的低氧敏感和低氧耐受的鱼，在固定区域中的丝氨酸数目小于40时就是低氧敏感的鱼类，反之则是低氧耐受的鱼。研究还分离和鉴定了14个新的胭脂鱼多态微卫星位点，分别来自于(CA)n和(GA)n的微卫星富集文库。每个位点的等位基因数目从6个到14个，观测杂合度（HO）和期望杂合度（HE）的变化范围分别是0.120-1.000和0.767-0.947。其中有五个位点显著的偏离哈迪-温伯格平衡。本文的创新点是多态的微卫星位点和HIF的研究为胭脂鱼的人工繁殖和遗传结构分析提供了理论指导，有利于其种群资源的恢复。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：胭脂鱼是国家二级保护动物，然而由于人类活动的参与使得其野生群体数目急剧下降。对低氧诱导因子以及微卫星的研究有利于人工养殖。 基本思路：通过设计兼并引物获得HIF-1α/2α/3α部分序列再设计特异引物，利用RACE技术获得cDNA全长，通过qRT-PCR分析时空表达。另外构建了微卫星文库，鉴定了14对微卫星引物。
科学性、先进性及独特之处
- 科学性：本研究使用随机大群体排除误差，微卫星引物严格筛选，保证其有效性，选择多个参照基因以保证实验的准确性和重复性。 先进性：通过RACE技术获得胭脂鱼的HIF-1α/2α/3α，使用qRT-PCR对其时空表达普进行分析。另外使用磁珠富集法分离了的多态性微卫星标记，并对群体做PAGE检测。 特色：分离中国的特有种胭脂鱼的三个HIF亚基，分离其微卫星引物。
应用价值和现实意义
- 应用价值：低氧调节因子的获得可以为人工养殖胭脂鱼在氧消耗方面提供理论基础。微卫星技术可以为进一步研究胭脂鱼遗传多样性、种群遗传结构奠定基础。 现实意义：HIF-αs的获得有助于研究鱼类低氧应激的分子调控机制；微卫星技术可用于筛选优良性状的亲本进行人工繁殖。两种技术结合的应用就是在胭脂鱼的人工养殖中。
学术论文摘要
- 中国胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）是长江特有的一种濒危的淡水鱼。低氧诱导因子（HIFs）是一种转录因子，本研究中分离了胭脂鱼的三个亚基HIF-1α, HIF-2α和HIF-3α的cDNA全长，其cDNA全长分别是3890 bp、3230 bp和3374 bp，分别编码780、782和632个氨基酸。通过实时荧光定量来分析三个亚基在不同组织和不同的胚胎发育时期的表达量变化。短期低氧处理实验（2.2, 2.8和3.2 mg/L的溶氧分别处理24小时）增加了HIF-1α和HIF-3α的mRNA表达水平，并且随着氧浓度的降低表达量会增加。在所有处理的条件下HIF-2α的表达水平都远远低于另外两个亚基。本研究也首先使用包含重要的低氧降解结构域ODD结构域的一个区域来区分鲤科鱼类中的低氧敏感和低氧耐受的鱼。研究还分离和鉴定了14个新的胭脂鱼多态微卫星位点，每个位点的等位基因数目从6个到14个，观测杂合度（HO）和期望杂合度（HE）的变化范围分别是0.120-1.000和0.767-0.947。其中有五个位点显著的偏离哈迪-温伯格平衡。本文的创新点是多态的微卫星位点和HIF的研究为胭脂鱼的人工繁殖和遗传结构分析提供了理论指导，有利于其种群资源的恢复。
获奖情况
- Isolation of polymorphic microsatellite loci from an endangered freshwater species Chinese sucker, Myxocyprinus asiaticus. Conservation Genetics Resources, 2010, 2, 73-75
鉴定结果
- 作品真实有效，作者本人承担了大部分研究。已发表的以及正在发表的论文均是相关实验的成果，作者本人均为第一作者。
参考文献
- 1.Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci from a dinucleotide-enriched genomic library of obscure puffer (Takifugu obscurus) and cross-species amplification. Conserv Genet (2009) 10:955–957 2.Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci from Yellowcheek (Elopichthys bambusa). Conserv Genet (2009) 10 (6): 1811-1813 3.HIF-1α and -2α genes in a hypoxia- sensitive teleost species Megalobrama amblycephala: cDNA cloning, expression and different responses to hypoxia. Comparative Biochemistry and Physiology Part B (2010) (3):273-280 4.Molecular cloning, characterization and expression of two hypoxia-inducible factor alpha subunits, HIF-1α and HIF-2α, in a hypoxia-tolerant marine teleost, Atlantic croaker (Micropogonias undulatus). Gene (2007) 2:273-282
同类课题研究水平概述
- HIF-1是低氧诱导结合蛋白，是一种碱基—螺旋—环—螺旋PAS异二聚蛋白质，有α 、β两个亚基构成。研究认为HIF-1是诱导低氧基因和修复细胞氧内环境的一核心调节因子。氧直接与氧感受器相互作用与线粒体呼吸无关，保持氧感受器处于失活状态；氧减少时氧感受器激活一种信号，经蛋白磷酸化及/或氧化还原，导致HIF-1/β表达升高，复氧后减少。据报道，在低氧条件下，很多基因受到低氧诱导因子的调控。在陆地动物中，尤其是在人和大鼠中低氧诱导因子研究较多，因为其与某些疾病是紧密相连的。在鱼类中国内外都有研究，但由于鱼的种类较多其研究的深度不够。本研究也只是得到了其cDNA全长序列，对其时空表达进行了分析，为以后更深入的研究奠定了基础。 微卫星(microsatellite)DNA标记又称SSR ( simple sequence repeats)标记或STR ( simple tandem repeat)标记，是指以少数几个核苷酸( 1～6 个)为单位多次重复的简单序列，是近年来发展起来的新一代分子标记技术。 微卫星存在于大多数生物的基因组中，被广泛的应用于遗传杂交育种和绘制染色体遗传图谱等领域。本研究主要是开发了中国特有的国家二级保护动物胭脂鱼的微卫星引物，我国已有学者通过RAPD、 PCR - RFLP和线粒体等标记技术对中国胭脂鱼的遗传结构进行了初步的探讨,但得到的多态性引物较少。也有学者对美国Deltistes luxatus上开发的引物对中国胭脂鱼进行试验，但是仅有少数引物能够与胭脂鱼共享。目前已知的仅有杨钟开发的18对胭脂鱼微卫星引物。由于过度捕捞、水域污染、水利工程建设等人为因素的影响，胭脂鱼的资源量已经急剧下降，作为我国和亚洲大陆唯一分布的单型属、种，对其进行保护刻不容缓。本研究开发了14对胭脂鱼微卫星引物，并对引物的有效性进行了检验。以此希望能够应用于胭脂鱼遗传多样性、种群遗传结构等进一步研究及人工增殖放流效果评估。
