基本信息
- 项目名称：
- 共轭亚油酸诱导小鼠脂肪肝的分子机制研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本试验通过给公鼠饲喂1.5%的共轭亚油酸，结果显示：小鼠肝脏重量和肝脏的脂质含量均显著增加；肝脏细胞的胞浆内呈现大量脂肪滴；血液中的转氨酶ALT、AST、ALP的活性升高，同时T-CHO、HDL均显著高于对照组（P＜0.05）；负责从肝外向肝内转运脂肪酸的CD36基因表达极显著上调3.63倍（P<0.01），负责合成VLDL的APOB100基因表达显著下调0.53倍（P＜0.05）。
- 详细介绍：
- 选取24只健康4周龄小公鼠，随机分为2组,每组12只。试验组饲喂含1.5%CLA的饲料、对照组饲喂含1.5%花生油的饲料。本试验采用剪趾标记法。 1 血液胰岛素含量的检测：将已饲喂20d的小鼠进行断尾取血，200μl/只，放入加有10μl EDTA的Ep管中，以4℃/12000rpm/10min的条件离心，吸取上清，用胰岛素放免试剂盒进行放免试验。 2 胰岛素耐受试验（ITT）：做完放免试验五天后，小鼠饥饿过夜，称重、测定葡萄糖含量，记为0min,再按0.5μl/g剂量注射胰岛素，分别于注射后3min、15min、30min、60min、90min、120min测定葡萄糖含量。 3 取组织：试验最后一天，按10μl/g剂量小鼠腹腔注射戊巴比妥钠，从腹主静脉取约1ml血，放入加有10μl EDTA的Ep管中， 4℃/12000rpm/10min离心，取上清，冻存于-80℃待检；完整取下肝脏，称重后记录，一部分放于多聚甲醛中，另一部分冻存于液氮中。 4 血液代谢分析：将血浆送到河南省中医学院检验科检测血液代谢变化。 5 肝脏脂质含量分析：提取肝脏脂质，然后采用甘油三酯试剂盒在自动生化分析仪上进行分析。 6 制备石蜡切片：取肝脏组织，经固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片摊片、脱蜡、H.E.染色、脱水透明、封固等过程制作切片。 7 组织RNA提取：取肝脏组织，用TRIZOL提取总RNA，通过凝胶电泳检测RNA的完整性，以NanoDrop-1000 微量核酸载体检测仪对提取的RNA进行纯度检验并测量浓度。采用M-MLV反转录酶（Promega）把RNA反转录成cDNA。 8 荧光定量PCR：取不同时期肝脏组织的cDNA，10倍梯度稀释,每个浓度重复三次, 在荧光定量PCR仪上进行反应，根据溶解曲线判断产物特异性，计算CT值和扩增效率。 9 mRNA相对表达量的计算：以GAPDH基因为内参（reference），通过公式对对照组和CLA组肝脏组织目的基因的mRNA相对表达量进行计算、分析。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的：通过给小鼠饲喂一定剂量的共轭亚油酸（CLA），诱导小鼠形成脂肪肝，并观察小鼠肝脏组织中基因表达的变化，探索CLA形成脂肪肝的机制。 思路：采用含一定剂量CLA的饲粮饲喂小鼠，检测血液中胰岛素含量，并做胰岛素耐受试验（ITT），测定肝脏重量和肝脏的脂质含量，进行血液代谢分析，同时制作肝脏石蜡切片，并进一步分析肝脏组织基因表达变化，探讨脂肪肝的形成机制。
科学性、先进性及独特之处
- 作品先从小鼠的肝脏重量、血液指标等表观数据研究脂肪肝的形成，再从肝脏基因表达变化等分子水平对脂肪肝的成因做进一步的探索，设计合理，研究手段先进。特别是发现CLA能使小鼠从肝外向肝内转运脂肪酸的CD36基因表达极显著上调，表明脂肪酸转运加强；而负责合成VLDL（向肝外转运脂蛋白）的APOB100基因的表达显著下调，表明肝脏向外转运脂蛋白的能力受到限制，造成了肝脏的脂肪蓄积现象，这一点颇有意义。
应用价值和现实意义
- 随着现在人们生活水平的提高，在医学实践中胰岛素抵抗、脂肪肝等代谢紊乱病的发病率越来越高，但其发病的分子机制还未明了。本试验用CLA饲喂小鼠的方法，成功地诱导小鼠产生了胰岛素抵抗和脂肪肝，并对其发生机制进行了探讨。 本项目为揭示代谢性疾病的发病机制，并为筛选药物干预脂肪肝形成打下了基础。
学术论文摘要
- 通过在饲料中加入1.5%的CLA，发现能够升高小鼠血液中胰岛素的含量，同时肝脏重量和肝脏的脂质含量均增加，小鼠形成脂肪肝。通过胰岛素耐受试验，发现CLA能够诱导小鼠形成胰岛素抵抗。通过制作肝脏组织石蜡切片，发现CLA能够使肝脏细胞的细胞核被挤到边缘或消失，胞浆内呈现大量脂肪滴。通过血液代谢分析，发现血液中的转氨酶ALT、AST、ALP的活性升高，同时T-CHO、HDL均显著高于对照组（P＜0.05）。同时对肝脏组织的基因表达进行分析，发现CLA能够使小鼠从肝外向肝内转运脂肪酸的CD36基因表达极显著上调，而负责合成VLDL的APOB100基因的表达显著下调，从而造成了肝脏的脂肪蓄积现象。
获奖情况
- 无
鉴定结果
- 无
参考文献
- [1] Wang YW,Jones PJH.Conjugated linoleic acid and obesity control:efficacy and mechanisms[J].International journal of obesity,2004,28:941-955. [2] West DB, Delany JP, Camet PM,et al.Effects of conjugated linoleic acid on body fat and energy metabolism in the mouse[J]. Am J Physiol, 1998, 275: 667-672. [3] Park Y, Storkson JM, Albright KJ,et al. Evidence that the trans-10, cis-12 isomer of conjugated linoleic acid induces body composition changes in mice[J]. Lipids,1999,34:235-241. [4] DeLany JP, BlohmF, Truett AA, et al. Conjugated linoleic acid rapidly reduces body fat content in mice without affecting energy intake[J]. Am J Physiol ,1999, 276: 1172-1179. [5] Tsuboyama-Kasaoka N, Takahashi M, Tanemura K, et al. Conjugated linoleic acid supplementation reduces adipose tissue by apoptosis and develops lipodystrophy in mice[J]. Diabetes, 2000, 49:1534-1542.
同类课题研究水平概述
- 1 CLA减少能量摄入和增加能量消耗 虽然很多研究已经发现日粮中添加CLA能够减少生长动物的体重、脂肪储存和体脂含量，这其中的调节机制仍然还有很多未知之处。一些试验表明添加CLA能够减少食物和能量的摄入，而一些其他试验发现CLA对于食物和能量没有任何影响。已经有报道食物中添加CLA能够导致动物机体脂肪储存的减少，但是对能量摄入上的影响很少。多个研究已经发现在日粮中添加CLA后，即使在能量摄入方面没有变化，机体的脂肪也有减少。从这些试验的结果中可以看出可能有其他的机制在其中发挥调节作用。 2 CLA减少脂肪细胞大小 在体外的研究发现，与添加亚油酸相比，在3T3-L1前脂肪细胞中添加CLA能够减少细胞甘油三酯的含量和脂肪细胞的体积，研究发现，在3T3-L1前脂肪细胞中添加t-10c-12CLA，6天后也减少了甘油三酯含量和脂肪细胞大小，因此脂肪组织重量的减少应该主要是由于脂肪细胞的体积减少所致，少量是由细胞数量的减少所致，这些推测已经被体内的动物试验所证实。 3 CLA改变前脂肪细胞分化 脂肪细胞的分化主要是由于一些基因表达程序化的改变所介导的。一些调节因子，如C/EBP和PPAR家族控制着前脂肪细胞的分化过程，这两类因子在前脂肪细胞分化到脂肪细胞的过程中发挥着重要作用。这些转录因子能够调节一些基因的表达，包括葡萄糖转移因子4（GLU4）、SCD，而这些基因现在已经用于研究细胞分化和特殊的组织表达。3T3-L1前脂肪细胞是一个体外研究脂肪细胞分化和扩增模型。CLA在脂肪细胞中一个靶基因可能是C/EBPα，这个基因在3T3-L1细胞分化时高表达，但是在扩增时不表达。添加CLA以后已经发现能够减少C/EBPα的表达。 4 CLA导致的胰岛素抵抗 CLA导致的脂肪减少现象已经获得了很多的关注，其中CLA在多个小鼠模型中观测到引起胰岛素抵抗。CLA引起的胰岛素抵抗可能是因为血液中瘦素含量的改变引起的。在多个动物模型中已经发现CLA引起了血浆瘦素含量的减少。给公鼠在高脂日粮中添加0.25~1%CLA，能够剂量依赖性的减少血液瘦素的含量。其他试验还发现添加1%CLA后雄性大鼠血液瘦素含量和脂肪重量都有所减少。试验还发现血液中瘦素的含量与肾周和睾丸的白色脂肪组织的重量有相关性。这些结果表明由CLA引起的脂肪组织的减少与瘦素含量降低有关，并且引发了胰岛素抵抗。
