基本信息
- 项目名称：
- 肿瘤特异性启动子调控胞嘧啶脱氨酶的抗肿瘤研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- BIRC5是在大多数恶性肿瘤中特异性高表达的肿瘤相关抗原，本研究克隆了其启动子，并利用报告基因GFP首先确定了其表达的肿瘤特异性，然后将克隆自酿酒酵母的前药基因胞嘧啶脱氨酶（CD）置于其调控之下，转染肿瘤细胞后加入5-FC，毛细管电泳检测表明BIRC5调控的CD能够有效地将5-FC转化成5-FU，从而杀伤肿瘤细胞，本研究为下一步体内的靶向性抗肿瘤研究及开发特异性的抗肿瘤基因药物奠定了良好的基础。
- 详细介绍：
- 手术治疗、放射治疗和化学药物治疗是恶性肿瘤治疗的传统手段，随着现代生物技术的发展，生物治疗日趋重要，而寻找有效的靶向性抗肿瘤治疗方法是生物治疗重要的研究方向之一。 BIRC5，又称为survivin，是凋亡抑制蛋白家族的成员之一，它表达于绝大部分常见的恶性肿瘤细胞中，但是在大部分正常组织中表达缺失或极低，是重要的肿瘤相关抗原。某些微生物的胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase，CD）能够把5-氟胞嘧啶（5-FC）转化成5-氟尿嘧啶（5-FU），通过抑制DNA的合成诱导细胞的凋亡。由于CD能将原本无毒的前体药物5-FC转化成具有细胞毒性的化疗药物5-FU，因此被称为“前药基因”或者“自杀基因”。本研究拟利用BIRC5启动子特异性地调控CD基因在肿瘤细胞中表达，配合5-FC处理，从而达到靶向性抗肿瘤的作用。 本研究首先克隆了BIRC5的启动子，利用报告基因GFP检测其调控下游基因的表达情况，通过分析GFP在不同细胞中的表达谱，表明克隆的BIRC5启动子具有良好的肿瘤相关性。然后克隆酿酒酵母的CD基因，将其置于BIRC5启动子的调控之下，构建成重组表达载体pSP-CD，将含有BIRC5启动子和酿酒酵母CD基因的pSP-CD转染肿瘤细胞，再加入5-FC进行处理。毛细管电泳检测表明转染了pSP-CD的肿瘤细胞能够有效地将5-FC转化为5-FU，微分干涉相差显微镜观察也显示BIRC5启动子调控下的CD/5-FC自杀系统能够靶向、有效地杀伤肿瘤细胞株HepG2；而在非肿瘤细胞株HEK-293对照组中，pSP-CD没有诱导明显的细胞凋亡现象。通过这一研究结果，希望为靶向性抗肿瘤生物治疗和开发肿瘤特异性的基因药物提供新思路。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 随着生命科学的不断发展，基因治疗成为恶性肿瘤治疗研究的一个活跃领域，而基因治疗的关键问题是靶向性。BIRC5是在大多数恶性肿瘤中高表达而在正常组织和细胞中表达缺失或极低的重要的肿瘤相关抗原，而某些微生物的胞嘧啶脱氨酶能够把无毒的5-FC转化成具有细胞毒性的5-FU，本研究拟将两者的优势联合起来，利用BIRC5启动子特异性地调控CD基因在肿瘤细胞中表达，希望为靶向性抗肿瘤治疗研究提供有益的借鉴。
科学性、先进性及独特之处
- BIRC5表达于绝大部分常见的恶性肿瘤细胞中，在大部分正常组织中表达缺失或极低；微生物的胞嘧啶脱氨酶（CD）能够把无毒的5-FC转化成具有细胞毒性的5-FU。本研究利用BIRC5启动子特异性地调控CD基因在肿瘤细胞中表达，从而达到靶向性抗肿瘤的目的。所用CD基因来自酿酒酵母，转化5-FC的效率高于大肠杆菌CD；利用毛细管电泳检测对5-FC的转化效率，直观明确的表明细胞凋亡和5-FC转化之间的联系。
应用价值和现实意义
- 肿瘤的生物治疗越来越为研究者所关注，但是目前治疗的靶向性仍是治疗的难题之一。本文的价值和意义在于，通过将具有高度肿瘤特异性的BIRC5启动子与定点杀伤靶细胞的CD自杀基因系统结合起来，充分发挥两者的优势，达到特异性杀伤肿瘤细胞而对正常组织影响较小的目的，从而为靶向性抗肿瘤生物治疗以及开发肿瘤特异性的基因药物提供前期的研究基础。
学术论文摘要
- 目的：利用BIRC5启动子的肿瘤特异性调控前药基因胞嘧啶脱氨酶（CD）的表达，使其在肿瘤细胞内将无毒的5-FC转化为化疗药物5-FU，探讨BIRC5启动子调控下CD/5-FC自杀系统的抗肿瘤效果。方法：利用PCR扩增BIRC5启动子，将其替换掉pEGFP-N1载体上的CMV启动子，构建成真核重组表达载体pSP-EGFP，转染不同的细胞系，通过报告基因绿色荧光蛋白（EGFP）的表达谱分析所克隆BIRC5启动子的肿瘤特异性；扩增酿酒酵母的CD基因，将其克隆在pSP-EGFP的多克隆位点中，构建成重组载体pSP-CD；将CD转染肿瘤细胞后加入5-FC，利用毛细管电泳仪检测对前药的转化效率，同时通过微分干涉差显微镜观察和流式细胞仪检测分析杀伤肿瘤细胞的效果。结果：EGFP的表达谱分析表明克隆的BIRC5启动子具有良好的肿瘤相关性；毛细管电泳检测表明肿瘤细胞中的CD能够有效地将5-FC转化为5-FU，微分干涉差显微镜和流式分析显示BIRC5启动子调控下的CD能够有效地杀伤肿瘤细胞。结论：BIRC5启动子具有显著的肿瘤特异性，能有效地启动CD基因的表达，达到靶向性杀伤肿瘤细胞的作用。
获奖情况
- 拟申请专利1项，投稿1篇。
鉴定结果
- 无
参考文献
- 1,Huang R, Zhao Z, et al. Targeting of tumor radioiodine therapy by expression of the sodium iodide symporter under control of the survivin promoter. Cancer Gene Ther, 2011,18(2):144-52 2,Ma L, Yue W, et al. Clinical Significance and Diagnostic Value of Survivin Autoantibody in Non-small Cell Lung Cancer Patients. Zhongguo Fei Ai Za Zhi, 2010, 13(7):706-12 3,Sher YP, Tzeng TF, et al. Cancer targeted gene therapy of BikDD inhibits orthotopic lung cancer growth and improves long-term survival. Oncogene, 2009, 28(37):3286-95 4,唐友红, 钟美佐,等.人类生存蛋白启动子的克隆及其在淋巴瘤细胞中的转录活性. 白血病•淋巴瘤,2010, 19(2):84-7 5,Chen JS, Liu JC. Cancer-specific activation of the survivin promoter and its potential use in gene therapy. Cancer Gene Ther, 2004, 11(11):740-7 6,Stolworthy TS, Korkegian AM, et al. Yeast cytosine deaminase mutants with increased thermostability impart sensitivity to 5-fluorocytosine. J Mol Biol, 2008, 377(3): 854-69 7,刘国彦,罗琪.CD/5-FC自杀基因体系对肝、胆、胰肿瘤细胞的杀伤作用及机制.世界华人消化杂志，2008,16(35):3946-52.
同类课题研究水平概述
- 当前肿瘤基因治疗研究中广泛应用的自杀基因主要有：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）和胞嘧啶脱氨酶基因（CD）。胸腺激酶将GCV转换成一种磷酸化的有毒代谢物（GCV-P）抑制DNA聚合酶，导致DNA链合成终止。CD将无毒的前药5-氟胞嘧啶（5-FC）脱氨基转化为有细胞毒性的化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU），后者最终代谢产物FdUMP能抑制胸苷酸合酶，导致dTTP池的耗尽而最终抑制DNA的合成。CD/5-FC系统相较于HSV-TK/GCV系统有一定的潜在的优势：首先，CD/5-FC系统产生的5-FU已经是临床上常用的化疗药物；其次，CD/5-FC系统有更强的旁观者效应，GCV-P需要细胞间隙连接通讯来杀伤未转化的临近肿瘤细胞，然而细胞间隙连接通讯在肿瘤细胞中经常缺失，而5-FU则无需间隙连接也能杀伤未转化细胞。 目前关于利用自杀基因进行抗肿瘤的研究中，大多集中在通过CD和TK联用，或者与放化疗等手段联用达到改进自杀基因杀伤效果的目的。通过肿瘤特异性的启动子对自杀基因进行调控的研究还比较少，并且研究的不够深入，如对前药的转化效率等具体机制涉及的不多。 关于BIRC5启动子的研究，Bao R，Connolly DC 等人的研究结果表明，BIRC5基因启动子可特异在肿瘤而非正常细胞内促进报告基因的转录，活性高于SV40启动子，说明肿瘤细胞中存在与正常细胞不同的转录因子谱，能特异激活BIRC5启动子，而该启动子在肿瘤细胞中启动下游基因表达的能力并没有组织或细胞特异性。Tang等对BIRC5启动子在淋巴瘤细胞中的转录活性进行了研究，结果表明BIRC5启动子在淋巴瘤细胞中具有较高的特异性。Chen等对BIRC5启动子驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的进行研究，表明含该启动子的重组质粒在肿瘤细胞中能增强Trail蛋白的表达,并能诱导HepG2肝癌细胞凋亡。 就目前的研究进展来看，对于利用BIRC5启动子调控CD基因进行靶向性抗肿瘤的研究还有待进一步加深，对相关的抗肿瘤效果和详细机制还有待进一步的研究和探索。
