基本信息
- 项目名称：
- 大鼠穹窿海马伞切割对海马伞内神经干细胞再生的影响
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 新近研究发现，外伤、神经退行性变等病理性刺激会诱导神经干细胞增殖，并向受损或退行性变的区域迁移。本课题组曾在去胆碱能神经支配的海马中发现自体神经干细胞增生，但是损伤的穹窿海马伞内神经再生情况尚不清楚。本研究切割穹窿海马伞，观察穹窿海马伞内的神经再生情况，结果发现在损伤的海马伞内发现了明显的神经干细胞再生。本研究的结果为利用自体神经干细胞治疗自身神经系统疾病提供重要的实验依据。
- 详细介绍：
- 神经干细胞(neural stem cells, NSCs)具有自我更新特性和多分化潜能，主要存在于成年哺乳动物的前脑室下带(subventricular zone, SVZ) 和海马齿状回颗粒下区（subgranular zone, SGZ）。正常情况下，SVZ中的神经干细胞迁移至嗅球并分化为颗粒和球旁神经元，而海马齿状回中的神经干细胞迁移至颗粒层并分化为颗粒神经元，这些神经元的轴突投射到海马的CA3区域，并与该区域的神经元发生突触联系。大鼠起自海马CA2、CA3、CA4锥体细胞的纤维，自海马传出, 参与形成海马伞，进入隔区成为穹窿, 止于丘脑前核、乳头体核、隔外侧核及斜角带核等；而大鼠基底前脑隔区内侧隔核和斜角带垂直支中胆碱能神经元发出的突起，又通过海马伞投射至海马，成为海马内乙酰胆碱递质的主要来源。切割穹窿海马伞，可阻断基底前脑胆碱能神经纤维向海马的投射，引起海马内乙酰胆碱递质的下降，从而导致动物学习记忆等认知功能的损伤。本课题组利用切割穹窿海马伞(fimbria fornix, FiFx)，阻断海马与其他脑区的纤维联系，制备去神经支配海马模型，模拟Alzheimer’s disease（早老性痴呆）。结果发现在失去胆碱能神经支配的海马中自体神经干细胞增殖加快, 并可向神经元分化。本课题在切割穹窿海马伞后，应用5-溴-2-脱氧尿苷(5-Bromo-2-deoxy-uridine, BrdU)和神经上皮干细胞蛋白(nestin)免疫荧光双标检测、神经干细胞体外分化等技术观察在胆碱能投射通路穹窿海马伞中自体NSC再生增殖的情况。结果表明，大量BrdU阳性细胞或nestin阳性细胞可在切割侧穹窿海马伞中检测到，这些细胞绝大部分为BrdU/nestin双标阳性，进一步推测这些双标阳性细胞可能为NSCs。取切割侧穹窿海马伞组织在体外进行培养，可获得相当数量的神经球，而用相同方法并不能从未切割侧海马伞中获得。之后将神经球进行体外诱导分化，免疫荧光化学检测，神经球可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。从而证明，在切割侧的BrdU和nestin双标阳性细胞为NSCs。与切割侧相比，在正常侧几乎没有观察到BrdU和nestin双标阳性细胞，表明穹窿海马伞切割损伤诱导了海马伞内NSC的增殖，而且这种增殖可能是为了损伤修复作准备。研究认为，当脑受到病理损伤等刺激后，脑内特定区域会出现神经前体细胞增生现象，推测这种增生与损伤区域的修复有关，如替代缺失的神经元、补充神经递质等。本实验中，切割穹窿海马伞后，海马对其他脑区的传出信号不能传出，同时也失去了其他脑区的神经传入支配，这就需要某些自身机制来修复这种损伤。在本课题组研究的损伤修复可能存在两种形式，一是投射纤维目的脑区的修复，这也是我们在前期实验中观察到的海马内的神经干细胞再生现象；二是投射纤维通路损伤周围结构的修复，在本实验中，损伤周围的海马伞中也发现了神经干细胞增生，预示着损伤区周围出现神经修复活动。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 神经系统再生是目前国内外研究的热点之一，对神经系统损伤的修复有着积极的意义。本作品利用去除海马的胆碱能神经支配，制备早老性痴呆模型。通过对海马伞的检测，研究神经干细胞在非神经元区域穹窿海马伞内的再生情况。研究目的是寻找非神经发生区神经再生的证据，为利用内源性神经干细胞治疗神经系统损伤提供了新的思路。
科学性、先进性及独特之处
- 神经干细胞具有自我更新特性和多分化潜能，在成年哺乳动物脑内，室下带和海马齿状回被认为是神经发生区。海马中胆碱能纤维主要由隔区胆碱能神经元经海马伞投射而来，故可以去除海马的胆碱能神经支配制备早老性痴呆模型。本研究发现，在损伤后的非神经发生区海马伞内检测到神经干细胞再生。这一结果在国内外尚未见到报道。表明，脑损伤可以诱导非神经发生区神经干细胞再生，为利用内源性神经干细胞治疗神经系统损伤提供新的依据。
应用价值和现实意义
- 本作品结果显示，穹窿海马伞切断之后，海马伞内出现明显的神经干细胞再生。表明，中枢神经系统中，损伤等应激反应可以透发非神经元区域的神经再生。从而提示，中枢神经系统疾病发生后，可以设法诱导内源性神经干细胞再生，以补充损伤/死亡的神经元。这些结果为利用内源性神经干细胞替代治疗神经退行性疾病提供了新的证据。
学术论文摘要
- 目的：检测切割穹窿海马伞后损伤的海马伞中自体神经干细胞的再生情况。方法：取SD大鼠7只，在立体定位仪上切割左侧穹窿海马伞，术后腹腔注射BrdU。7天时取脑冰冻切片，行nestin、BrdU免疫荧光检测；取术后7d的穹窿海马伞组织进行神经干细胞的体外分离培养。将获得的细胞，进行nestin与BrdU免疫荧光检测；利用Accutase将分离培养获得的细胞团制成单细胞悬液，接种于24孔培养板中，加入含10%血清的培养基诱导分化。再对分化的细胞进行MAP-2、GFAP和CNP免疫荧光检测。结果：切割侧穹窿海马伞中见到较多的nestin和BrdU阳性细胞，部分细胞表现为BrdU/nestin双重阳性；而在正常侧比较少见。取切割侧穹窿海马伞组织进行分离培养能获得神经球表现为nestin与BrdU阳性，而正常侧海马伞未能培养出神经球；分化所得的细胞中，一部分为MAP-2阳性的神经元，一部分为GFAP阳性的星形胶质细胞，还有一部分为CNP阳性的少突胶质细胞。结论：切割穹窿海马伞后，切割侧穹窿海马伞中出现了自体神经干细胞的再生及增殖。
获奖情况
- 1.2010年某某大学医学院第一届大学生课外学术作品竞赛中获得一等奖。 2.2010年某某大学第三届大学生课外学术作品竞赛中获得特等奖。
鉴定结果
- 本作品得到2010年某某省高等学校大学生实践创新训练项目的资助，该项目已经完成，并已结题。目前尚未鉴定。
参考文献
- 现有技术 (1)去神经支配海马模型制作。 (2)脑组织冰冻切片。 (3)免疫组织化学方法检测海马伞内神经干细胞再生情况。 (4)分离模型动物的海马伞，神经干细胞培养。 (5)神经干细胞特性检测。 (6)神经干细胞体外诱导分化及检测。文献： 1.Zhang X, Jin G, Wang L, Hu W, Tian M, Qin J, Huang H (2009) Brn-4 is upregulated in the deafferented hippocampus and promotes neuronal differentiation of neural progenitors in vitro. Hippocampus 19:176-186. 2.Zhang X, Jin G, Tian M, Qin J, Huang Z (2007) The denervated hippocampus provides proper microenvironment for the survival and differentiation of neural progenitors. Neurosci Lett 414:115-120. 3.张新化，金国华，秦建兵，田美玲，黄镇，徐慧君。穹窿海马伞切割侧海马对植入神经干细胞分化为神经元的影响。神经解剖学杂志，2004, 20(4): 360-364. 4.张新化，金国华，田美玲，黄镇，秦建兵，徐慧君。神经干细胞植入大鼠海马中的迁移。某某医学院学报，2002, 22(2): 119-122.
同类课题研究水平概述
- 神经干细胞(neural stem cells, NSCs)具有自我更新特性和多分化潜能。可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在成年哺乳动物主要存在于前脑室下带(subventricular zone, SVZ) 和海马齿状回颗粒下层（subgranular zone, SGZ）。正常情况下，SVZ中的神经干细胞迁移至嗅球并分化为颗粒和球旁神经元，而海马齿状回中的神经干细胞则迁移至颗粒层，分化为颗粒神经元，并投射到海马的CA3区，与该区的神经元发生突触联系。可见，神经干细胞可以作为理想的细胞来源治疗神经系统疾病。目前对利用神经干细胞治疗神经系统疾病的研究主要集中在两个方面：一是在体外诱导神经干细胞向神经元分化，再移植到病变区域，替代退变或死亡的神经细胞，重新建立神经网络，从而达到治疗的目的。然而，神经干细胞只有极少部分分化为神经元。如何促进神经干细胞向神经元分化是急需解决的问题，目前还没有非常有效的方法诱导神经干细胞向神经元分化； 二是直接利用神经干细胞替代治疗神经系统疾病或损伤。有两种方法，1、“替代治疗”：移植外源性神经干细胞以替换损伤或退变的神经细胞；2、“补充治疗”：激活内源性神经干细胞代偿丢失的神经细胞。其中“补充治疗”可以避免异源免疫排斥反应和伦理问题。新近研究发现，外伤、神经退行性变等病理性刺激会诱导内源性NSC增殖，并向受损或退行性变的区域迁移。因此，“补充治疗”更为合理可行。本作品的前期工作发现去胆碱能神经支配的海马中内源性神经干细胞增生，并向神经元分化。但是损伤的穹窿海马伞内神经再生情况尚不清楚。本研究在损伤成年大鼠海马伞中发现了神经干细胞再生，这一现象在国内、外是首次发现。这一研究的结果为利用自体神经干细胞治疗自身神经系统疾病提供重要的实验依据。
