基本信息
- 项目名称：
- p14多肽——新型黄科病毒解螺旋酶抑制剂的克隆表达系统构建及抗病毒研究
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 目的：研究新型抗病毒肽-猪瘟病毒p14肽对猪瘟病毒的抗性研究。方法：通过SOE PCR法扩增目的基因，基因片段克隆至pET32a（+）质粒中，构建重组原核表达系统，表达出的原核蛋白纯化后，采用实时定量PCR法和间接免疫荧光法对4种黄科病毒的进行抗性研究。同时将TAT转导域同p14肽相结合。结果：通过两种方法的对比，猪瘟病毒p14肽抗猪瘟病毒效果最明显，TAT-p14串联肽抗病毒效果更强。
- 详细介绍：
- 黄病毒科病是一种重要的引起严重疾病的动物传染病病原体，调查表明黄病毒科病毒存在一段保守蛋白：p14蛋白。这种蛋白表现出很强的抗病毒活性，也是一种发展潜力巨大的抗病毒的治疗药物。在本项目中，我们主要研究作为猪瘟病毒NS3解旋酶抑制剂的p14蛋白对猪瘟病毒的抑制作用。我们首先鉴定了p14蛋白的抗病毒活性，然后将p14蛋白同HIV-1 TAT蛋白串联结合，有利于蛋白转导进入细胞。p14蛋白在体外实验中表现出很高的抗病毒活性，我们就此猜测串联多肽在p14蛋白的基础上活性会有所提高。因此，在本项目中，我们首次将p14蛋白应用于抗猪瘟病毒的活性研究，结果证实p14蛋白的确对猪瘟病毒具有良好的抗性。在此基础上，我们又将p14蛋白同TAT转导域相结合，研究串联多肽的抗病毒性。结果证实，串联多肽比单一的p14蛋白活性有一定的提高。
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作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 目的:本项目以猪瘟病毒为研究对象，试图开发出一种绿色环保的蛋白质抗病毒药物：抗猪瘟病毒p14肽。基本思路：1、TAT蛋白转导域，p14蛋白基因的克隆、表达和纯化。2、基因工程表达TAT蛋白转导域，p14蛋白以及联合蛋白的研究。3、TAT蛋白转导域，p14蛋白以及联合蛋白体外抗病毒活性比较。
科学性、先进性及独特之处
- 利用猪瘟病毒体内本身含有的一段基因序列，表达出的蛋白，可通过抑制病毒解螺旋活性，影响病毒的复制，杀灭病毒自身。 （1）本课题初次应用对载体密码子的改造来优化表达系统，证明该系统稳定性好，通透性强，活性好。 （2）本课题首次将p14肽应用于猪瘟病毒的检测。 （3）本课题首次将TAT同p14肽相结合，形成串联式抗病毒肽。
应用价值和现实意义
- （1）本研究合成的猪瘟p14蛋白为抗猪瘟病毒药物研发提供了一个新方向，并打下坚实的理论基础。 （2）在体外实验中证明，此p14蛋白的抗猪瘟病毒浓度是ug级别，即只需少量的多肽即可达到抗病毒的效果。 （3）基因过程技术表达的p14蛋白仅针对病毒发挥作用，对细胞没有影响，不会因此而造成副作用。 （4）应用基因工程技术制备p14蛋白，目的抗病毒基因可源源不断的制备蛋白，原料成本极低。
学术论文摘要
- Flaviviridae viruses are important zoonosis pathogens which cause serve diseases. Report showed that Flaviviridae viruses have a conservative protein motif (14aa).Therefore, our studies focus on this 14aa antiviral peptide which acts as a classical swine fever virus NS3 helicase inhibitor. We determined the antiviral activity of the 14aa peptide first. Combined the 14aa peptide with HIV-1 TAT peptide, which helps protein transduction in cells.
获奖情况
- 1.本项目立项于2009年，为我省大学生科技创新项目，2010年结题。编号为DFCS200902。 2.在《中国生物制品学》杂志上发表论文《HIV-Tat蛋白转导域的研究进展》。 3.核心内容已投SCI杂志《Journal of veterinary medical science》。
鉴定结果
- 1、目前未见将p14肽应用于猪瘟病毒的相关报导。 2、目前未见CSFV p14肽，BVDV p14肽，JEV p14肽，HCV p14肽抗猪瘟病毒活性对比研究的报导。
参考文献
- 1.Kerkis A, Hayashi MA, Yamane T, et al. Properties of cell penetrating peptides (CPPs). IUBMB Life 2006; 58(1):7-13. 2.Ganges L, Núñez JI, Sobrino F, Borrego B, Fernández-Borges N, Frías-Lepoureau MT, Rodríguez F Recent advances in the development of recombinant vaccines against classical swine fever virus: Cellular responses also play a role in protection. The Veterinary Journal 2008； 177:169-77. 3.Mae M, Langel U. Cell-penetrating peptides as vectors for peptide, protein and oligonucleotide delivery. Curr Opin Phamacol 2006; 6(5):509-514. 4. Rachmat H, Motoko NF, Lin D, et al. Hepatitis C virus NS3 protein interacts with ELKS-d and ELKS-a, members of a novel protein family involved in intracellular transport and secretory pathways. J Gen Virol 2005; 86:2197-2208. 5. Khan AA, Babu JP, Gupta G, Rao DN Identifying B and T cell epitopes and studying humoral, mucosal and cellular immune responses of peptides derived from V antigen of Yersinia pestis. Vaccine2008；26:316-332.
同类课题研究水平概述
- 1、病毒性感染一直是困扰人及动物健康的重要问题，目前还没有找到一种可以直接消灭病毒感染的药物。国内外绝大多数学者认为，病毒感染的治疗需要从抑制病毒感染机体的各个阶段入手，研制对病毒感染多方面起作用并有分子可塑性的抗病毒蛋白对防治病毒感染有重要价值。科学家先是从昆虫体内提取出某些蛋白，这些蛋白对特异性的病毒有抑制或杀伤作用，这些蛋白被称之为抗病毒肽。随后，科学家又在多种抗病毒肽中发现一种含14个氨基酸的小肽p14，可以抑制黄病毒科乙肝病毒的解螺旋酶。 2、猪瘟病毒一直是威胁养殖业的一个重要病原。对于猪瘟病毒，我国一直采取接种疫苗的政策，并且在过去较长时间内效果明显，猪瘟得到了有效地控制。但是最近很多研究检测结果证实，猪瘟发病出现许多非典型症状，病毒在与疫苗的对抗中也渐渐发生变异，有逃避免疫的倾向。而许多接种过疫苗的动物仍检测到了猪瘟病毒存在。因此，研究出一种高效抗病毒并能适应病毒新变异的抗病毒多肽就显得尤为重要。 3、科学家已证实p14蛋白在丙型肝炎病毒感染中发挥抑制作用。p14可通过结合病毒的解旋酶或丝氨酸蛋白酶，干扰病毒解螺旋作用而抑制病毒复制，是一种新发现的病毒抑制蛋白。 4、综上，我们研究室基于p14蛋白对黄病毒科病毒解螺旋酶的抑制作用，提出一个假想。猜测体外人工大量合成的p14蛋白，可以通过抑制病毒解螺旋酶活性治疗猪瘟疫。同时，本研究室尝试将TAT转导域同p14肽相结合，期望能增强细胞穿透性，进一步提高抗病毒性。
