基本信息
- 项目名称：
- 中药钩藤的分子生物学与化学鉴定
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”省赛作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 本项目运用rDNA ITS区序列测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法，联合HPLC—DAD技术与中药色谱相似度评价系统的化学分析方法，对钩藤属植物进行准确的种间鉴定。
- 详细介绍：
- 钩藤中药材的化学成分研究表明，其主要有效成分为生物碱，但不同种的药效成分有明显的差别。目前，中药钩藤的分类鉴定主要依据形态学、组织学和化学成分等传统分析方法，由于这些方法的局限性，钩藤中药材在中药市场上的分类鉴定比较混乱，在药材使用上存在互混、互代、以次充好等现象，影响了用药的安全性和有效性。 在DNA保存完整的情况下，对亲缘关系相近的钩藤属植物进行鉴别，DNA分子鉴定技术无疑是最直观的方法。但是，加工炮制或萃取后的中药材钩藤核酸已被破坏，DNA 分子鉴定技术不适用于中药材成品的鉴定。而化学成分分析方法可以很好地反映药材成品的化学本质，可根据钩藤属成品的化学成分及其含量的不同对其进行种间鉴别。因此，联合运用分子生物学和化学成分分析技术进行钩藤属不同种间的鉴定，既提高了钩藤属中药鉴定的准确度又扩大了鉴定方法的适用范围。 在分子生物学上，采用改良CTAB法提取钩藤总DNA，并进行rDNA ITS区的PCR扩增。对扩增产物进行胶回收纯化，再连接到质粒载体中，接着转化到大肠杆菌感受态细胞中，培养过夜进行蓝白斑筛选。最后将含钩藤rDNA ITS区序列的克隆子进行测序，得到的序列通过与国际基因数据库中已有的ITS区序列进行比较分析，对钩藤属种间进行鉴定。 在化学成分分析上，提取钩藤属样品生物碱后采用高效液相色谱法分离有效生物碱，再以色谱联用技术获得钩藤属生物碱的色谱图，并与对照品溶液（由已鉴定的钩藤药材制备）的色谱图进行对比分析以定性鉴别。最后用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对收集到的生物碱色谱图和钩藤对照药材进行比较，鉴定钩藤属药材。
作品专业信息
撰写目的和基本思路
- 联合应用分子生物学技术和化学成分分析技术，对钩藤属种间进行鉴定。在分子生物学上，用改良CTAB法提取钩藤总DNA，并进行rDNA ITS区的PCR扩增。经克隆、测序后，运用软件进行序列分析和构建系统发育树。在化学成分分析上，采用高效液相色谱法及色谱联用技术获得钩藤样品及对照品生物碱色谱图。最后用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对收集到的生物碱色谱图进行比较分析，鉴定钩藤属药材。
科学性、先进性及独特之处
- 本作品结合rDNA ITS序列分析技术与化学成分分析技术，对钩藤属种间进行鉴定。而且，对其不同种间进行鉴定的研究还很少。因此，本作品在方法和在内容上都具有独特之处。方法上，联合运用以上两种方法，既提高了鉴定的准确度又扩大了方法的适用范围；内容上，虽然钩藤属中药具有较高的药用价值，但相应鉴定技术还不够成熟，市场上以次充好现象较多，限制其推广。本项目提供了更准确全面的鉴定方法，将对其推广有积极作用。
应用价值和现实意义
- 针对钩藤中药材在中药市场上的分类鉴定比较混乱，本研究小组联合运用分子生物学和化学成分分析技术进一步对钩藤属种间进行鉴定，能够解决钩藤属中药材在使用上存在的互混、互代、以次充好等现象，提高用药的安全性和有效性。
学术论文摘要
- 目的 通过测定钩藤属植物核糖体转录间隔（rDNA ITS）序列和分析钩藤的HPLC色谱图，同时对其进行分类鉴定。 方法 1）通过改良CTAB法提取2010年《中国药典》中记载的五种入药钩藤植物总DNA，利用通用引物对rDNA ITS序列进行PCR扩增，将测序后得到的序列与国际基因数据库中已有的ITS区序列进行比较分析。运用Clustal X，BioEdit和PAUP等软件进行序列分析和构建系统发育树；2）以已鉴定的钩藤对照品为参照，采用HPLC-DAD联用技术，并应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）对收集到的生物碱色谱图和购自中国药品生物制品检定所的钩藤对照药材进行比较，以实现钩藤属种间的分类鉴定。 结果 1）获得五种入药钩藤的rDNA ITS区的完整序列并构建钩藤属植物的系统发育树；2）获得五种钩藤的HPLC色谱图谱及其与对照图谱的相似度比较。 结论 通过rDNA ITS序列进行序列测定，能够对钩藤属植物进行准确的分子鉴定，HPLC-DAD联用技术则能快速地对钩藤属中药材成品进行鉴定。两种方法互补，既提高了钩藤属中药鉴定的准确度又扩大了鉴定方法的适用范围。
获奖情况
- 1.获得广东药学院2010年校级大学生创新实验项目立项资格； 2.2010年10月在国家核心期刊“中草药”上发表论文：毛钩藤和无柄果钩藤的ITS序列分析研究； 3.2011年3月在国家核心期刊“中国中药杂志”上发表实验论文：一种钩藤属植物的分子鉴定。
鉴定结果
- rDNA ITS区序列的测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法，以及HPLC—DAD技术与中药色谱相似度评价系统的化学分析方法，能够对钩藤属植物进行准确的种间鉴定，为其鉴定和分类提供了科学理论依据。
参考文献
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同类课题研究水平概述
- 钩藤具有清热平肝、息风定惊之功效，用于治疗风热头痛、头晕目眩等症，为中医儿科要药和现代治疗高血压方剂中的常用药材。目前，中药钩藤的分类鉴定主要依据形态学、组织学和化学成分等传统分析方法，由于这些方法的局限性，钩藤中药材在中药市场上的分类鉴定比较混乱，影响了用药的安全性和有效性。分子生物学技术已在药用植物的分子系统发育分析中广泛地应用，但对钩藤属植物的资源调查和种间分子鉴定等基础研究工作还少有报导，仅有陶刚曾对贵州中药材钩藤属植物进行分子鉴定并归类到属。近十年，国内外钩藤属种间鉴定等调查研究方面的基础工作还很少，国内仅有不超过5篇关于中药钩藤鉴定研究的文献，其中贵州省研究人员发表了钩藤的有效成分、药理活性、资源分布等方面的研究论文约3篇。这些研究现状表明，当前对中药钩藤属植物的鉴定仍然缺乏深入的研究。所以，探索出更简单有效的方法来进行钩藤属种间鉴定是迫切的。
