基本信息
- 项目名称：
- 拟南芥G蛋白信号转导调节蛋白（AtRGS1蛋白）的亚细胞定位与表达
- 来源：
- 第十二届“挑战杯”作品
- 小类：
- 生命科学
- 大类：
- 自然科学类学术论文
- 简介：
- 根据AtRGS1蛋白的特有结构，克隆表达AtRGS1的两个结构域，蛋白质相互作用技术证明分段克隆的C端结构域和Gα相互作用，GFP融合蛋白表达技术证明：RGS1全长蛋白及RGS1-N定位于细胞膜，RGS1-C定位于质膜和细胞核。葡萄糖和ABA处理改变RGS1-F及RGS1-C的细胞定位表达，而RGS1-N和RGS1（E320K）定位及表达未发生改变。为揭示RGS1蛋白的功能及其作用机制奠定了基础。
- 详细介绍：
- 异三聚体G蛋白介导的信号转导途径是真核生物中最保守的信号转导途径之一。拟南芥G蛋白信号转导调节蛋白（Regulator of G-protein Signaling Protein in Arabidopsis thaliana，AtRGS1）在G蛋白介导的信号转导途径中起着十分重要的作用。本文根据AtRGS1蛋白的特有结构，将编码AtRGS1的两个结构域分别进行克隆表达，split-ubiquitin技术证明分段克隆的C端结构域和G蛋白α亚基相互作用，结合RGS1-GFP融合蛋白表达技术阐明：AtRGS1全长蛋白（AtRGS1-F和AtRGS1(E320K)）及AtRGS1-N端结构域定位于细胞膜，AtRGS1-C端结构域定位于质膜和细胞核。AtRGS1-N端结构域在ABA和葡萄糖处理前后都主要分布于细胞膜上，未发生迁移，表明在细胞响应胁迫信号时，AtRGS1-N端结构域可能在细胞膜上起到对外界胁迫信号感受的作用。AtRGS1-C端结构域在未处理前主要分布于细胞膜上和细胞核中，说明AtRGS1蛋白在缺少其N端结构域时，不能特异地定位在细胞膜上。葡萄糖处理后，AtRGS1-C端结构域在细胞膜上和细胞核中的表达均有所增强， ABA处理后，AtRGS1-C端结构域在整个细胞内均有分布。当将RGS结构域第320位谷氨酸点突变为赖氨酸，抑制了RGS的GAP活性，则削弱了葡萄糖和ABA对RGS蛋白表达的影响。推断AtRGS1-N端结构域是AtRGS1蛋白定位于细胞膜上所必需的，在细胞响应胁迫信号时，AtRGS1-C端结构域可以与AtRGS1-N端结构域分离，进入胞内，进行信号的传递。为进一步揭示AtRGS1蛋白的生物学功能和深入研究其在G蛋白介导的信号转导途径中的作用机制奠定了基础。
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撰写目的和基本思路
- 将AtRGS1进行分段克隆表达，建立相应基因型的拟南芥悬浮细胞系，结合RGS1-GFP融合蛋白表达技术，研究AtRGS1蛋白的细胞定位及ABA和葡萄糖对AtRGS1蛋白的细胞定位和表达的影响，探讨AtRGS1蛋白的两个结构域在响应葡萄糖和ABA信号转导途径中的功能。为进一步揭示AtRGS1蛋白的生物学功能和深入研究其在G蛋白介导的信号转导途径中的作用机制奠定基础。
科学性、先进性及独特之处
- G蛋白信号转导蛋白（RGS）是G蛋白信号转导通路中一个重要的环节，但有关植物中RGS蛋白的研究才刚刚起步。“拟南芥G蛋白信号转导蛋白（AtRGS）的亚细胞定位与表达” 选题具有科学性和前沿性；采用分段克隆的方法分别阐述蛋白质各结构域的功能，实验思路和技术先进；其结果不但可阐明RGS蛋白在细胞中的分布，揭示其生理功能，而且可为植物中RGS的研究提供系统的植物材料。
应用价值和现实意义
- 蛋白质的“区域化分布”和“定位控制”是蛋白质行使其功能及调节生长发育的重要方面，本研究根据AtRGS1蛋白的特有结构，将编码AtRGS1的两个结构域分别进行克隆表达，结合RGS1-GFP融合蛋白表达技术阐明了AtRGS1蛋白在胞内的分布，及ABA和葡萄糖对AtRGS1定位的影响，为进一步深入研究AtRGS1蛋白在ABA和葡萄糖信号转导中的作用机理奠定了理论基础。
学术论文摘要
- 异三聚体G蛋白介导的信号转导途径是真核生物中最保守的信号转导途径之一。拟南芥G蛋白信号转导调节蛋白（Regulator of G-protein Signaling Protein in Arabidopsis thaliana，AtRGS1）在G蛋白介导的信号转导途径中起着十分重要的作用。本文根据AtRGS1蛋白的特有结构，将编码AtRGS1的两个结构域分别进行克隆表达，split-ubiquitin技术证明分段克隆的C端结构域和G蛋白α亚基相互作用，结合RGS1-GFP融合蛋白表达技术阐明：AtRGS1全长蛋白（AtRGS1-F和AtRGS1(E320K)）及AtRGS1-N端结构域定位于细胞膜，AtRGS1-C端结构域定位于质膜和细胞核。D-葡萄糖和ABA处理可以改变AtRGS1-F及AtRGS1-C端结构域的亚细胞定位表达，而AtRGS1-N端结构域和AtRGS1（E320K）定位及表达未发生改变。为进一步揭示AtRGS1蛋白的生物学功能和深入研究其在G蛋白介导的信号转导途径中的作用机制奠定了基础。
获奖情况
- XX大学第六届挑战杯•动感地带大学生课外学术科技作品竞赛生命科学类一等奖。
鉴定结果
- 查新报告表明关于拟南芥G蛋白信号转导调节蛋白（AtRGS1蛋白）的亚细胞定位与表达的研究和关于AtRGS1、N端、C端结构域定位的研究，在国内外公开发表的文献中，未见有相同报道。
参考文献
- 1.Chal FM, Tu Y, Euskirchen G (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263:802-805； 2.Chen JG, Willard FS, Huang J, Liang J, Chasses SA, Jones AM, Siderovski DP (2003) A seven-transmembrane RGS protein that modulates plant cell proliferation. Science 301:1728-1731； 3.Chen Y, Ji F, Xie H, Liang J, Zhang J (2006) The regulator of G-protein signaling proteins involved in sugar and abscisic acid signaling in Arabidopsis seed germination. Plant Physiology 140:302-310； 4.Chen Y, Ji F, Xie H, Liang J (2006) Overexpression of the regulator of G-protein signaling protein enhances ABA-mediated inhibition of root elongation and drought tolerance in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany 57:2101-2110； 5.Dulin NO, Pratt P, Tiruppathi C, Niu J, Voyno-Yasenetskaya T, Dunn MJ (2000) Regulator of G Protein Signaling RGS3T Is Localized to the Nucleus and Induces Apoptosis. Journal of Biological Chemistry 275(28):21317-21323。
同类课题研究水平概述
- G蛋白介导的细胞信号转导是真核生物细胞信号转导机制中最为保守的信号转导机制之一，其介导的信号转导持续时间的长短取决于Gα-GTP的寿命。20世纪90年代，Siderovsiki等三个实验室在酵母等真核生物细胞中发现了G蛋白信号转导调节蛋白（RGS），该蛋白显著促进Gα的GTP水解酶活性，终止G蛋白介导的信号转导过程。在酵母和动物细胞里, RGS和GPCR是两个功能相反的分子。但拟南芥的RGS1很有趣，Chen等首次报道在拟南芥中鉴定到AtRGS1，它的N-端是一个类似于GPCR的7次跨膜结构域，C端是一个RGS结构域，遗传分析显示RGS1在植物体内刚好与激活态的GPA1的作用相反。RGS1也参与了细胞分裂和糖信号的响应，但对AtRGS1蛋白在G蛋白介导的信号途径中的作用，以及其它生物学功能还不十分清楚。那么，AtRGS1的整体功能，即它是一个既有GPCR又有RGS双重功能的蛋白，还是一个受配体调控的RGS蛋白，至今还没有定论。因此，明确AtRGS1的整体功能显得十分重要。本课题组首次证明：葡萄糖抑制种子萌发是通过ABA生物合成的，AtRGS1通过调节ABA生物合成两个关键酶NCED3和ABA2而调节ABA生物合成；通过调节ABA合成和ABA响应基因的表达而调节植物生长发育过程，通过表达AtRGS1提高植株对ABA的敏感性，增加了对干旱胁迫的忍耐。说明RGS1在脱落酸和葡萄糖信号途径及其它途径中起重要的调节作用。动物中，RGS通常还含有一个或多个别的结构域，参与了胞内其它信号途径。拟南芥AtRGS1除了RGS结构域的功能得到验证以外，它的N端结构域功能和整体功能尚不清楚。Grigiston报道AtRGS1通过其N端结构域与AtGPA1相互作用，可能作为葡萄糖的膜响应元件。在细胞水平，AtRGS1作为一个膜蛋白，定位于细胞膜，但ABA和葡萄糖处理增加了AtRGS1在核区的表达（Chen et al.,待发表数据）。那么，感受外界信号的是AtRGS1全蛋白，还是某个结构域？其上下游的效应蛋白有哪些？AtRGS1胞内表达变化与ABA和葡萄糖信号传递有何联系？蛋白质的“区域化分布”和“定位控制”是蛋白质行使其功能的重要方面，本文旨在阐明AtRGS1的胞内分布，及ABA和葡萄糖对AtRGS1定位的影响，为深入研究AtRGS1蛋白的作用机理提供理论基础。
